梅毒實驗室檢測方法的研究進展

劉 兵馮文莉*

（1 山西醫科大學，山西 太原 030001；2 山西醫科大學第二醫院皮膚性病科，山西 太原 030001）

梅毒實驗室檢測方法的研究進展

劉 兵1馮文莉2*

（1 山西醫科大學，山西 太原 030001；2 山西醫科大學第二醫院皮膚性病科，山西 太原 030001）

梅毒是一種嚴重危害人類健康的性傳播疾病，臨床上主要借助實驗室檢測對其進行診斷。近年來，快速、靈敏和特異性高的檢測方法在不斷更新完善中。本文主要從病原學、血清學、分子生物學、腦脊液四方面對梅毒實驗室診斷的最新進展作一綜述。

梅毒；病原體；血清學；分子生物學；腦脊液

梅毒（syphilis）是由蒼白密螺旋體的蒼白亞種即梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）所引起的一種慢性、接觸性傳染病，近年來其發病率有明顯上升趨勢[1]。TP由Fritz Schaudinn和Erich Hoffmann于1905年首次發現，為纖細的密螺旋體，運動活潑，可以旋轉、蛇行、伸縮三種方式運動，感染機體后可產生兩類抗體：一類為非特異性抗體，該類抗體能與廣泛分布于生物組織中的類脂抗原發生非特異性反應；另一類為特異性抗體。針對TP生物學及免疫學特性，梅毒實驗室診斷技術主要是從病原體、血清學、分子生物學、腦脊液四方面開展。

1 病原體直接檢測

1.1 暗視野顯微鏡檢查TP（DF）：暗視野顯微鏡可直接觀察到病灶分泌物中運動活躍的蒼白螺旋體，結合臨床癥狀可直接診斷梅毒。該法操作簡單，且經濟、快速，但敏感性較低，檢測陽性率為65%～70%，主要受病程、某些外加因素以及檢測人員技術水平影響，而且對部分二期梅毒皮疹、隱性梅毒或口腔病灶標本不適用。

1.2 鍍銀染色方法檢查TP（Wartbin starry）：由于TP具有親銀性，可將TP染成棕褐色或黑褐色，且層次清楚，反差明顯，形態清晰，背景為黃色，TP易被著色辨認，封片后可以永久保存標本。缺點是鍍銀染色液需新鮮配制，且不能觀察TP的運動方式，易與類似TP的其他物質混淆，故臨床應用很少，多用于科研和教學。

1.3 免疫熒光抗體染色：該法將TP用異硫氰酸熒光素標記的抗TP抗體或單克隆抗體染色，利用抗原抗體特異性反應，熒光顯微鏡觀察抗原抗體復合物出現綠色熒光，表明檢測標本中含有TP，但需要熒光顯微鏡設備，技術條件要求較高。

2 梅毒血清學檢測

梅毒血清學檢測根據所用抗原不同可分為非特異性抗體檢測和特異性抗體檢測兩大類[2]。

2.1 非特異性抗體檢測

2.1.1 康瓦試驗：是最早檢測梅毒患者體內抗體的方法，這種試驗的抗原采自牛心肌粉酒精浸液。此試驗操作復雜，易出現假陽性，目前這種試驗已被臨床淘汰。

2.1.2 性病研究實驗室試驗（VDRL）：該法屬于微量玻片法，以心磷脂為抗原，加入膽固醇增強靈敏性和加入卵磷脂以提高抗原性，定性及定量檢測血清中的抗類脂質抗原的非特異性抗體。該實驗操作簡單、快速，2 h內出結果。但是技術要求高，抗原懸液不穩定，要求待測血清新鮮而且需要加熱滅活，結果需要借助顯微鏡觀察。

2.1.3 不加熱血清反應素玻片試驗（USR）：本法是VDRL檢測技術改良后的方法，改良措施是在抗原懸液中加入了二胺四乙酸二鈉滅活補體從而使懸液更加穩定可保存4個月，又在懸液中加入了氯化膽堿可對待測血清直接化學滅活從而減少了加熱滅活步驟，從而在檢測時更加快速、方便。缺點是需要借助顯微鏡，主觀性強，易出現漏檢。

2.1.4 快速血漿反應素環狀卡片試驗（RPR）：利用從牛心中提取出來的有效成分—心磷脂、卵磷脂及膽固醇組成抗原，然后用特制的活性炭顆粒進行吸附，通過肉眼觀察白色紙板上有無黑色凝集顆粒出現而直接進行結果判斷。該方法操作簡便、迅速，適用于大批量標本檢測。缺點是當抗體含量過高時，易出現假陰性反應，即前帶現象（promne phenomenon），會有漏檢；還易出現生物學假陽性反應，但是RPR試驗可檢測抗體滴度變化，RPR滴度變化是觀察治療效果、復發或再感染的重要指標。

2.1.5 甲苯胺紅不加熱血清反應素試驗（TRUST）：該法用類脂質（從牛心提取的心磷脂和從雞蛋黃提取的卵磷脂及膽固醇）為抗原來檢測血清中的抗類脂質抗體，原理與RPR試驗類似，只是以甲苯胺紅染料顆粒代替活性炭顆粒做吸附劑。試驗結果清晰易讀，簡便快速，穩定性好，但對一期梅毒、三期梅毒及隱性梅毒進行檢測時會出現假陰性反應，尤其是三期梅毒。

2.2 特異性抗體檢測

2.2.1 熒光密螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）：試驗以非致病性密螺旋體Reiter株作為抗原來吸收待測血清，排除了同屬抗原交叉結合的可能性，特異性好。而且該法因采用了整條螺旋體進行檢測，敏感性高。文獻報道FTA-ABS對各期梅毒檢測的特異性達到92%，對一期梅毒的敏感性為80%，二期為99%～100%，三期為95%～100%[3]；缺點是使用了活菌，存在一定的潛在危險性。而且需要使用熒光顯微鏡，對設備和操作要求較高，所以該法的使用受到了限制。

2.2.2 TP血球凝集試驗（TPHA）：用羊或火雞紅細胞做抗原載體，吸附從兔睪丸中提取的粗制TP粉碎物抗原，檢測血清中TP特異性抗體。由于試劑制備過程排除了各種非特異性反應，敏感性和特異性均較高。但試劑成本較高，操作較麻煩，且易發生自凝現象和生物學假陽性[4]。

2.2.3 TP明膠凝集試驗（TPPA）：主要是把致病性TP的精致菌株成分包被在人工載體明膠粒子上檢測血清中相應的抗體，該試驗是TPHA的改良方法。姜澤升[5]對98例梅毒患者給予TPPA檢測后，其合計陽性率為100%，結果表明TPPA具有敏感性高、特異性高等特點，是目前國內公認的梅毒確證方法，梅毒確診的“金標準”[6]。但因其操作復雜，反應時間長，不易保存且出具滴度結果時成本較高，故臨床上TPPA常用于對篩檢為陽性標本進行確診。

2.2.4 TP酶聯免疫吸附試驗（TP-ELLISA）：該法采用基因工程體外表達得到的TP特異抗原（常用TpN47 TpN15 TpN17）包被微孔滴定板，同時檢測血清中的抗TP-IgM和抗TP-IgG抗體，利用酶的放大效應，提高檢測的靈敏度，因采用了純化的基因重組抗原，提高了其檢測的特異性。在低危人群中篩查的靈敏度可達到93.8%～99%，并可實現自動化[7]。Sun[8]報道TP嵌合基因重組抗原（TpN15-47-17）及單一抗原TpN47 TpN15 TpN17分別構建雙抗原夾心ELISA，平行檢測965份梅毒陽性血清，結果證實前者比后者敏感度提高。由于此法操作簡便，不受樣本纖維蛋白和溶血等影響，一次可完成多份標本的檢測，試驗結果由儀器分析，客觀而準確，特別適用于大批血源標本的篩檢。

2.2.5 TP膠體金試驗（CGT）：運用雙抗原夾心法的原理，以膠體金作為標志物，用特異性TP抗原作為包被和標記抗原，在硝酸纖維素膜上進行反應來檢測待測血清中的TP特異性抗體。Nessa[9]用此法檢測684份女性性工作者，與TPPA方法相比較，靈敏度為94.45%，特異性為92.6%，認為這是一種非侵襲性的梅毒快速篩查方法。Lin[10]等采用優化了的具有梅毒特異性的重組蛋白TPN17和TPN47作為標記抗原，建立檢測血清中梅毒抗體IgM的TP金標法，經過多年的驗證，其敏感性、特異性分別為98.21%和99.04%。

2.2.6 蛋白印跡試驗（WB）：該試驗是通過電泳轉移硝酸纖維膜抗原條上含有TP的各種成分來確認是否梅毒感染。近年來多采用具有高度免疫原性重組多肽抗原進行檢測，有更好的敏感性和特異性。Welch[11]報道WB法用于梅毒確認試驗優于TPPA，對二期梅毒、早期梅毒、神經梅毒陽性率為100%。對于生物學假陽性標本、r球蛋白增高和自身抗體的標本檢測沒有假陽性和可疑反應。

2.2.7 化學發光免疫測定（CLIA）。該法的原理為：標本或包被有重組TP抗原的微粒子與稀釋液混合后，標本中的抗TP抗體同微粒子上包被的TP抗原結合，清洗后，加入標記吖啶脂（acridinium）的抗人IgM或IgG抗體，在進行另一步洗滌程序后，加入預激發液和激發液，通過測定反應液的相對光強度來檢測血清TP特異性抗體水平。該法從檢測到結果判定均由儀器自動完成，操作方便，人為干擾少，結果客觀準確。Antonella[12]等用RPR、CLIA、TPHA、WB、ELISA五種方法對131份梅毒血清進行水平檢測，CLIA法的敏感性最高，為99.2%，由此可見該法在梅毒特異性抗體檢測中具有一定的優勢。

2.3 基因診斷技術檢測：近年來，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術已得到廣泛應用。PCR是一種體外擴增DNA技術。當存在模板DNA、底物、上下游引物和耐熱DNA聚合酶時，經過多次變性、復性、延伸反應的循環過程，模板DNA就可得到大量擴增。進行PCR檢測，選擇特異性高的靶基因是DNA擴增首先考慮的問題。目前已有幾套擴增梅毒螺旋體DNA的基因如47ku、39ku（bmp）、TPF1 tmpA、tmpB、PolA編碼基因[13]。但是除梅毒螺旋體DNA多聚酶Ⅰ基因（TP-PorA）特異性較高外，大部分與其他微生物具有一定的同源性，特異性還不理想[14-15]。梅毒PCR檢測方法有常規PCR、巢式PCR、逆轉錄PCR、多重PCR和實時PCR。常規PCR只需要設計一對相應的引物，擴增后需做凝膠電泳鑒定，故操作比較繁瑣，同時擴增產物極易受到污染造成假陽性。巢式PCR先用一對外引物進行第一輪PCR，然后再使用第一對引物擴增的DNA序列內部的一對引物再次擴增，因其采用2對引物進行2輪擴增，因此敏感性和特異性均有所增強[16]。逆轉錄PCR是提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA；再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。用于逆轉錄PCR設計引物的靶基因是16srRNA，也需要Southern印跡雜交試驗來保證其特異性，因此，操作比較繁瑣，臨床上不常使用。多重PCR是在同一個反應管中用多對引物同時擴增幾條DNA片段，目前常用于與其他病原體同時檢測[17]。實時熒光定量PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用對熒光信號積累的實時檢測來監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[18]。由于PCR是直接檢測TP-DNA，所以其檢測的敏感勝和特異性均高于血清學檢測，此外，良好的特異性使PCR技術在鑒別梅毒與其他螺旋體感染時顯現了其獨特的應用價值。PCR檢測尤其適用于微量TP檢測，如先天性梅毒、早期梅毒。這是因為人體感染TP后要到4～10周才產生一定水平的抗體，特異性抗體比非特異性抗體早約1周出現；缺點是PCR檢測的假陽性較高，檢測敏感性會受標本來源和所處病期的限制。此外，PCR檢測對實驗室條件和操作人員有一定的要求，且檢測成本較高。因此，PCR不能替代血清學檢測，只能作為血清學檢測的補充。

2.4 腦脊液的檢查：用于診斷神經梅毒，包括細胞計數、蛋白定量、VDRL、PCR檢測和膠體金法。腦脊液細胞數和總蛋白量增加不是一種特異性反應，只有腦脊液VDRL試驗才是神經梅毒的可靠性診斷依據[19]。

3 展 望

梅毒實驗室檢測技術眾多，但是每種方法都存在一定的局限性，綜合考慮利弊，不難得出血清學檢測方法仍然是梅毒實驗室診斷的主要方法，而且隨著近幾年分子生物學技術的快速發展，以重組抗原作為診斷抗原的特異、靈敏、快速、簡便、低成本的血清學方法是發展趨勢，但是目前重組抗原仍不能用于臨床各期梅毒，需要進一步評價其他新的重組抗原在梅毒診斷中的意義，從而尋求一種在檢測各期梅毒時靈敏度和特異度都能達到“金標準”所要求的百分比的重組抗原，這將為梅毒患者早發現、早診斷、早治療帶來前所未有的前景。

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R759.1

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