過表達D5 Stat5a促進前列腺癌細胞增殖及IGFBP-7基因啟動子組蛋白甲基化

聶璽 張潔 余超 譚敦勇

吉首大學醫學院生物化學與免疫學系，湖南吉首416000

過表達D5 Stat5a促進前列腺癌細胞增殖及IGFBP-7基因啟動子組蛋白甲基化

聶璽 張潔 余超 譚敦勇

吉首大學醫學院生物化學與免疫學系，湖南吉首416000

目的探討D5 Stat5a對人類前列腺癌細胞增殖的影響及其對胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP-7）表達的影響。方法常規培養人前列腺癌細胞（DU145及PC3），并隨機分為四組：對照組及三個實驗組。對照組以不含外源基因的腺病毒感染，三個實驗組細胞則以攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染，其病毒感染增殖活性（MOI）依次為10、20及30。四組細胞均在培養液中加入催乳素（50 ng/mL）以啟動細胞信號轉導。運用MTS方法檢測細胞增殖；實時定量PCR檢測抑癌基因IGFBP-7及EZH2 mRNA水平；染色質免疫共沉淀技術（ChIP）檢測IGFBP-7基因啟動子區域組蛋白甲基化程度；蛋白質印跡法檢測IGFBP-7蛋白表達。結果攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染能夠呈劑量依賴式地促進前列腺癌細胞（DU145及PC3）增殖。如PC3細胞，對照組細胞的相對活細胞數為（1.362±0.018），三個實驗組相對活細胞數分別為（1.453±0.022）（P＞0.05）、（1.649±0.020）（P＜0.05）及（1.829± 0.027）（P＜0.05）。實時定量PCR及蛋白印跡證明D5 Stat5a過表達明顯下調IGFBP-7的表達。DU145及PC3對照組細胞IGFBP-7 mRNA相對值分別為（0.796±0.023）及（0.871±0.046），而感染攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒（MOI 30）后，其IGFBP-7 mRNA相對值則分別下降到（0.148±0.019）（P＜0.01）及（0.078±0.021）（P＜0.01）。染色質免疫共沉淀分析（ChIP-Assay）證實，D5 Stat5a導致IGFBP-7基因啟動子區域組蛋白甲基化（H3K27Me3）水平顯著上升。DU145細胞對照組與實驗組，其沉淀DNA比例分別為（0.0176±0.0030）%及（0.0650±0.0099）%，兩者差異有高度統計學意義（P＜0.01）。此外，實時定量PCR檢測表明，D5 Stat5a引起組蛋白甲基轉移酶EZH2 mRNA大幅上升。DU145細胞對照組及D5 Stat5a感染組相對mRNA水平分別為（0.0033±0.0004）及（0.0160±0.0035），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論轉錄因子D5 Stat5a能夠顯著促進人類前列腺癌細胞的增殖，其主要的表觀遺傳學機制在于D5 Stat5a增加EZH2基因表達，導致抑癌基因IGFBP-7啟動子區域組蛋白甲基化，使啟動子活性降低，IGFBP-7表達下降，是導致前列腺癌細胞的異常增殖分子機制之一。

D5 Stat5a；前列腺癌細胞；表觀遺傳學；組蛋白甲基化；染色質免疫共沉淀

轉錄因子Stat5（signal transduction and activation of transcription 5）是催乳素、生長因子以及一系列細胞因子信號通路的重要環節［1-2］，在乳腺以及前列腺的發育、分化［3-4］等生理活動中起著極為重要的作用。Stat5基因表達異常會導致乳腺以及前列腺發育以及生殖功能障礙等一系列病理過程的出現［5］。Stat5包括Stat5a及Stat5b兩種，兩者高度同源，且作用相近，由兩個獨立基因編碼［6］。有人推測，Stat5a及Stat5b基因由同一個組基因復制而來［6］。有證據表明，Stat5的異常表達可能參與了某些生殖腫瘤尤其是乳腺癌及前列腺癌等的病理過程［7］。但有關Stat5在腫瘤如乳腺癌及前列腺癌形成、發展及預后中的確切作用，目前尚無定論，且有關此方面的報道，多相互矛盾。Sultan等［8］曾檢測人類乳腺癌組織中Stat5a的表達，結果發現，Stat5a的表達量與患者的預后有密切關系，Stat5a表達量越高預后越好。而更多的研究則表明，Stat5作為一種病理因素參與了前列腺癌及乳腺癌的發病過程［9］。

D5 Stat5a是最近自人前列腺腺癌細胞及乳腺癌細胞所克隆的Stat5a的一種變體［10-11］，因其N-端30個氨基酸丟失且對應于此30個氨基酸的基因DNA恰好為Stat5a基因的第5個外顯子（90個堿基對），因而將此變體命名為Delta 5 Stat5a或簡稱D5 Stat5a。筆者以前的工作已經證明，該變體在生物學特性上與全長的Stat5a有共同點，例如作為轉錄因子，依然能夠響應相應的配體如催乳素所啟動的細胞信號，進而二聚化并完成核轉位，最后與相應的DNA位點結合。但除此之外，此變體在生物學功能上卻有著極為重要的區別，主要表現D5 Stat5a能夠與不同的其他轉錄因子交互作用，并顯著促進某些癌細胞如乳腺癌及前列腺癌細胞的增殖及去分化。D5 Stat5a在人類乳腺癌組織及前列腺癌細胞有異常表達［10］，意味著D5 Stat5a可能是前列腺癌、乳腺癌得以形成的一種重要的病理因素。胰島素樣生長因子結合蛋白-7（insulin-likegrowth factor 7，IGFBP-7）與胰島素樣生長因子受體具有很強的結合活性，能夠阻擋胰島素樣生長因子（IGF）與其受體的結合，因而IGFBP-7能夠抑制胰島素樣生長因子的活性［12］，進而調節細胞的增殖、凋亡等過程［13］。有報道表明，IGFBP-7對腫瘤細胞的增殖有抑制作用［13-14］。本研究除了檢測及確認D5 Stat5a對培養狀態的人類前列腺癌細胞DU145及PC3增殖的影響外，利用實時定量PCR、蛋白印跡（Western blot）及染色質免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）分析等方法，分析高表達D5 Stat5a對胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP-7）基因表達的影響以及其啟動子區域表觀遺傳學修飾的改變（組蛋白甲基化），以期闡明D5 Stat5a與前列腺癌的病理聯系及其可能的表觀遺傳學機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

人類前列腺癌細胞DU145、PC3（中南大學細胞庫）、RPMI 1640培養液（美國Gibco公司）、抗H3K27Me3抗體（美國Millimore公司）、抗IGFBP-7抗體（美國Santa Cruz生物公司）、細菌蛋白G磁珠（美國Invitro gen公司）、細胞增殖分析試劑MTS［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium］以及蛋白印跡顯影試劑ECL（Enhanced chemiluminescent substrate）（美國Promega公司）。

1.2 攜帶D5 Stat5a cDNA腺病毒制作

為提高基因轉移效率，本研究采用腺病毒基因轉移法，其制作方法依據Stratagene公司建議的制作程序。基本步驟：①將D5 Stat5a cDNA克隆至穿梭載體（pShuttle-IRES-hrGFP-1）；②利用同源重組原理將穿梭載體的D5 Stat5a cDNA上傳到腺病毒基因組（Ad5），該病毒基因組經人工改造去掉其與病毒復制有關的E1及E2序列；③確認重組成功后，將其轉入經特殊處理的細菌株（XL10-GoldR）大量擴增（重組體在該細菌內只能擴增但不能再發生新的重組以保證重組的準確及穩定）；④提取重組體，以限制性內切酶PacⅠ進行酶切處理以暴露其末端反向重復序列（invert terminal repeat，ITR），然后將其轉入AD-293細胞，使其包裝成有活性的病毒；⑤病毒活性（滴度）以病毒感染AD-293細胞后形成病毒斑塊的能力（plaque forming unit，PFU）表示，而PFU總數與待感染的細胞總數之比值即為病毒感染增殖活性（multiplicity of infection，MOI）。

1.3 細胞培養、腺病毒介導的基因轉移及活細胞計數（MTS法）

人類前列腺癌細胞（DU145、PC3）用RPMI 1640培養液（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞的貼壁密度或貼壁面積為70%時，棄去培養液，用含0.5%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養細胞24 h（細胞處于饑餓狀態）以使所有細胞均處于G0期后，換為正常培養液，當細胞貼壁密度達到70%后，細胞（DU145及PC3）隨機分為四組：對照組及三個實驗組。對照組以不含外源基因的腺病毒感染，三個實驗組細胞則以攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染，其病毒MOI依次為10、20及30。病毒感染120 min后，換為正常培養液，四組細胞均在培養液中加入催乳素（50 ng/mL）以啟動細胞信號轉導（細胞增殖實驗時四組之外另設一組對照細胞，不加催乳素）。繼續培養48 h后，加入MTS試劑并測定其波長為492 nm的吸光值，得到相對活細胞計數。

1.4 染色質免疫共沉淀分析（ChIP Assay）

人類前列腺癌細胞（DU145、PC3）經病毒感染處理后，吸棄培養液，并以冰冷的PBS（phosphate buffer solution）緩沖液洗3次，繼之：①以新鮮配制的1%甲醛固定，10 min后，以甘氨酸終止甲醛活性；②吸棄甲醛固定液，以細胞收集液（100 mmol/L Tris-Cl，pH 9.4，10 mmol/L DTT）收集細胞，冰冷PBS緩沖液洗細胞3次，加入細胞裂解液（1%SDS，10 mmol/L EDTA，pH 8.0，50 mmol/L Tris-Cl，pH 8.1，1×蛋白酶抑制劑），并以超聲粉碎儀破碎基因組DNA至500 bp左右片段；③以ChIP稀釋液（1%Triton X-100，2 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.1，1×蛋白酶抑制劑）1∶10稀釋；④加入抗H3K27Me3抗體，4℃輕搖過夜（與此同時，另設一平行管，加入IgG以得到非特異性結合的數據）；⑤以含細菌蛋白G的磁珠沉淀；⑥以洗脫液（1%SDS，TE緩沖液配制）將DNA-H3K27Me3-抗體復合物自磁珠上洗脫；⑦65℃過夜以解除固定，繼之用蛋白酶H消化蛋白（抗體）；⑧純化DNA；⑨實時定量PCR檢測、確認被抗H3K27Me3抗體沉淀的DNA中是否含有IGFBP-7基因啟動子區域DNA序列及含量。

1.5 實時定量PCR（quantitativerealtimepolymerasechain reaction，qRT-PCR）

本研究中使用實時定量PCR有兩個目的，一是染色質免疫共沉淀后，需要確認被沉淀的DNA序列；二是檢測IGFBP-7基因的表達狀況。其操作步驟依照公司說明書進行：①引物設計，本研究的PCR引物包括用于檢測染色質免疫共沉淀后DNA的引物（對應于IGFBP-7基因啟動子序列進行設計）以及用于檢測IGFBP-7及EZH2 mRNA的引物，見表1；②底物為SYNR Green；③PCR參數，變性95°C 1 min，退火55℃，30 s，延伸72℃，30 s，收集40個循環的熒光強度，并得到相應的Ct值；④ChIP DNA的相對量以未經免疫沉淀時DNA中所含IGFBP-7基因DNA量（Input）為參照，計算其被沉淀的IGFBP-7啟動子序列DNA占Input的百分數。IGFBP-7 mRNA的相對量則以管家基因18 SrRNA為對照計算。具體計算方法如下：相對mRNA量=（每個樣本的18S rRNA的Ct值-每個樣本的IGFBP-7的Ct值）2。

1.6 蛋白質印跡（Western Blot）法

人前列腺癌細胞（PC3）經攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染后，吸棄培養液，并經冰冷PBS洗3次，收集細胞并加入細胞裂解液（RIPA），12 000 r/min離心，收集上清，測定蛋白濃度，然后進行下述步驟：①電泳分離：樣本加入上樣液并經煮沸5 min變性，每孔上樣20 μg，100V電泳90 min；②轉膜：應用半干轉膜裝置（Bio-Rad）7 V轉膜45 min；③抗原抗體反應：上述經蛋白轉移后的硝酸纖維素膜，經PBST（phosphate buffered saline tween 20）洗3次（每次10 min）并經非特異位點封閉后，加入抗IGFBP-7抗體，4℃過夜，第2天進行二抗反應；④顯影：運用ECL試劑并經X光片記錄發光強度及位置。

1.7 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差表示，本實驗所測得數據呈正態分布者被視為有效數據，組間比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D5 Stat5a對人類前列腺癌細胞增殖的影響

對照組細胞，分別給予或不給予催乳素（50 ng/mL）處理，結果顯示給予催乳素處理后，相較于沒有給予催乳素處理的細胞，其細胞增殖略顯增加，但兩者之間的活細胞計數差異無統計學意義（P＞0.05）。三個實驗組細胞，則由于感染不同劑量（MOI 10、20及30）的腺病毒（攜帶D5 Stat5a cDNA），在加入催乳素的情況下，其活細胞計數呈劑量依賴式增加。DU145及PC3細胞，D5 Stat5a均有促進其增殖的作用。PC3細胞對照組（加入催乳素）相對活細胞計數為（1.362± 0.018），當MOI分別為10、20及30時，其活細胞相對計數分別為（1.453±0.022）（P＞0.05）、（1.649±0.020）（P＜0.05）及（1.829±0.027）（P＜0.05）；DU145細胞，對照組相對活細胞計數為（1.339±0.0233），當MOI分別為10、20及30時，其活細胞相對計數分別為（1.391±0.018）（P＞0.05），（1.629±0.030）（P＜0.05）及（1.755±0.026）（P＜0.01）。見圖1。

2.2 D5 Stat5a過表達對IGFBP-7基因表達的影響

運用qRT-PCR及Western blot方法檢測了DU145及PC3細胞的IGFBP-7 mRNA水平以及PC3細胞的IGFBP-7蛋白水平。結果如圖2A所示，DU145及PC3細胞在轉入含有D5 Stat5a cDNA的腺病毒后，IGFBP-7 mRNA下降明顯，當細胞分別感染攜帶D5 Stat5a cDNA病毒MOI 10、20及30后，DU145細胞IGFBP-7 mRNA相對值由對照細胞的（0.796±0.023）減少至（0.752±0.068）（P＞0.05）、（0.534±0.007）（P＜0.05）及（0.148±0.019）（P＜0.01）；PC3細胞IGFBP-7 mRNA相對值由對照細胞的（0.871±0.046）減少至（0.690±0.047）（P＞0.05）、（0.472±0.075）（P＜0.01）及（0.078±0.021）（P＜0.01）。與之相應，PC3細胞中IGFBP-7蛋白水平，在D5 Stat5a作用下亦出現下降（圖2B），對照細胞IGFBP-7蛋白相對值為（1151.387±55.909），當感染病毒MOI 10、20及30時，其IGFBP-7蛋白相對值分別為（1035.863± 36.028）（P＞0.05）、（798.233±71.806）（P＞0.05）及（283.577±35.715）（P＜0.01）。

2.3 D5 Stat5a對前列腺癌細胞IGFBP-7基因啟動子組蛋白甲基化的影響

如結果“2.1”所示，過量表達Stat5a能夠顯著促進培養狀態的前列腺癌細胞的增殖。IGFBP-7是細胞周期的關鍵調控因子之一，有報道表明，前列腺癌組織IGFBP-7表達往往出現異常（降低）。筆者推測，D5 Stat5a促進前列腺癌細胞增殖可能與改變IGFBP-7基因的表達有關。本研究a在探討D5 Stat5a能否改變IGFBP-7基因啟動子區域的表觀遺傳學。本研究檢測了組蛋白3的第27位賴氨酸的甲基化程度（H3K27Me3），前列腺癌細胞（DU145及PC3）經不含（Con）或含有D5 Stat5a cDNA的腺病毒（D5）轉染后，沿染色質免疫共沉淀途徑固定細胞、超聲得到500 bp左右染色質DNA片段，以抗H3K27Me3抗體沉淀后，得到相應DNA片段，最終以實時定量PCR探測IGFBP-7啟動子區域DNA片段。結果表明，過量表達D5 Stat5a的細胞，其染色質沉淀中含有大量被抗H3K27Me3沉淀的DNA片段。如圖3所示，DU145細胞對照組與實驗組，其沉淀DNA比例分別為（0.0176± 0.0030）%及（0.0650±0.0099）%，兩組比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）；PC3細胞對照組與實驗組，其沉淀DNA比例分別為（0.0142±0.0009）%及（0.0480± 0.0036）%，兩組比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）；說明D5 Stat5a能夠導致IGFBP-7啟動子區域的H3K27的三甲基化。實驗中，本研究還使用了非特異性IgG抗體進行沉淀，結果表明，所有組別的DNA沉淀比例均低于0.005%，表明染色質免疫共沉淀是特異的。此外，為消除引物對基因組DNA的非特異性結合的影響，還運用了非特異性無關引物進行檢測，結果表明，無關引物并沒有探測到明顯的被沉淀的DNA片段，所有組別的DNA沉淀比例均低于0.005%（P＜0.01），說明染色質沉淀是基因特異的。

2.4 D5 Stat5a過表達上調EZH2基因表達

EZH2（Enhancer of Zesste Homology 2）是一種組蛋白賴氨酸N甲基轉移酶，主要作用于核小體組蛋白3的27位賴氨酸殘基（H3K27），導致3個甲基集團轉移至H3K27（H3K27Me3），因而EZH2是導致H3K27Me3形成的關鍵因素。在結果“2.3”所示實驗的基礎上，進一步檢測了前列腺癌細胞過表達D5 Stat5a之后對EZH2表達的影響。結果顯示，D5 Stat5a能夠顯著上調EZH2 mRNA水平，DU145細胞對照組及D5 Stat5a感染組（MOI 30）其相對mRNA水平分別為（0.0033± 0.0004）及（0.0160±0.0035），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。PC3細胞分別為（0.0038±0.0014）及（0.0200±0.0021），兩組比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見圖4。提示D5 Stat5a首先通過提升EZH2基因表達水平，繼而導致IGFBP-7基因啟動子區域組蛋白的甲基化。

3 討論

關于轉錄因子Stat5a在生殖系統腫瘤形成中的作用，是近十年來研究人員關注的焦點之一［15］，有關Stat5在乳腺癌及前列腺癌的形成、發展及預后方面的真正作用，目前尚無定論。盡管已經有不少報道，將Stat5的表達與生殖系統癌癥聯系起來，但從報道的結果看，往往相互矛盾。Sultan等［8］報道表明，Stat5a的含量越高癌癥患者（例如乳腺癌）的預后越好，說明Stat5a是一種抑癌因素。也有報道表明，Stat5a作為一種病理因素參與了腫瘤（如乳腺癌）的形成和發展［9］。D5 Stat5a的發現為解決這一矛盾提供了新的思路，筆者以前的工作已經證明，作為轉錄因子，D5 Stat5a與全長的Stat5a一樣，能夠在相應細胞信號的作用下，完成二聚化及核轉移，并與相應的靶基因啟動子區域結合啟動基因轉錄，但D5 Stat5a其N'-端30個氨基酸的丟失又導致了D5 Stat5a與全長的Stat5a具有不同的功能［10-11］。主要表現在D5 Stat5a對人乳腺癌細胞（MCF-7及T47D）以及前列腺癌細胞（DU145）的增殖有較強的刺激作用，而全長的Stat5a無此作用。同時，由于全長的Stat5a及D5 Stat5a兩者只相差30個氨基酸，兩者的分子量相差很小（一為94 kD，一為92 kD），一般的Western blot很難將其分離，這也就是為什么D5 Stat5a沒有被更早發現的原因之一。因而前述筆者報道的有關Stat5a的作用可能實際上包含Stat5a及D5 Stat5a兩種分子的作用，這也部分解釋了出現矛盾結果的原因。

本研究采用腺病毒介導的基因轉移法使前列腺癌細胞得以過量表達Stat5a。根據以前的經驗，在基因轉染過程中，若采用化學轉移法（如使用lipofectamine等試劑轉染），人類乳腺癌細胞（T47D、MCF-7）及前列腺癌細胞的轉移效率較低（低于50%），因而影響試驗結果。本研究采用腺病毒介導的基因轉移法，理論上，轉移效率可以達到90%以上。本研究首先檢測了過量表達D5 Stat5a后對細胞增殖的影響。結果表明，過量表達D5 Stat5a之后，DU145及PC3的細胞密度，顯著上升，且呈劑量依賴關系。此外，由于催乳素是Stat5a及D5 Stat5a的有效激活劑，本研究設置了兩組對照，兩組對照均以不攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒（空病毒）進行轉染，其中一組細胞不加入催乳素，而另一組對照則加入催乳素以激活D5 Stat5a。結果發現，加入催乳素的對照組，雖然沒有過量表達外源D5 Stat5a，但細胞密度亦有少量增加，應為催乳素刺激激活內源性D5 Stat5a所致（腫瘤細胞在自然狀態下亦可生成D5 Stat5a）。根據本研究結果認為，至少在細胞增殖方面，D5 Stat5a所起作用為病理性的。

IGFBP-7能夠有效影響IGF與其相應受體的結合，是調控細胞增殖的因素之一［16］，其表達與腫瘤的發生、發展及預后有一定的關系［11］。多數學者認為，IGFBP-7屬于抑癌因素，其基因屬于抑癌基因［17］。為闡明D5 Stat5a的促進細胞增殖作用是否與IGFBP-7有關，本研究運用qRT-PCR及Western blot法對過表達D5 Stat5a的前列腺癌細胞IGFBP-7 mRNA及蛋白表達水平進行了檢測，結果如預期，過量表達D5 Stat5a能夠顯著下調IGFBP-7的mRNA及蛋白水平。這一結果提示D5 Stat5a促進前列腺癌細胞及乳腺癌細胞（筆者以前的實驗結果）的增殖，其途徑之一是抑制抑癌基因IGFBP-7的表達。

為探討D5 Stat5a如何抑制IGFBP-7基因的表達，本實驗運用染色質免疫共沉淀法，對過量表達D5 Stat5a后的前列腺癌細胞IGFBP-7基因啟動子區域的表觀遺傳學修飾進行了檢測。在攜帶D5 Stat5a cDNA的腺病毒轉染，并經1%甲醛固定后，DU145及PC3染色質DNA經超聲粉碎至500 bp左右的片段，以抗H3K27Me3抗體對DNA片段進行沉淀。結果表明，IGFBP-7基因啟動子區域DNA被大量沉淀，說明過量表達D5 Stat5a能夠促進IGFBP-7基因啟動子區域H3K27Me3修飾。H3K27Me3對基因組DNA與組蛋白的相互作用具有非常直接的影響。大量研究表明，這一修飾能夠嚴重干擾與轉錄有關的蛋白質因子進入基因啟動子區域，從而抑制基因的轉錄表達［18］。由此，筆者確認上述D5 Stat5a抑制IGFBP-7表達，是由于D5 Stat5a導致了IGFBP-7基因啟動子區域H3K27Me3，從而封閉IGFBP-7基因啟動子所致。此外，如結果圖3所示，在對照組DU145及PC3細胞，與使用抗IgG的非特異性抗體相比，使用抗H3K27Me3抗體，沉淀后其所含IGFBP-7基因啟動子片斷較多，推測導致這一現象的原因，可能是前列腺癌細胞實際上在D5 Stat5a作用前，已經存在IGFBP-7基因啟動子H3K27Me3現象。

由于H3K27Me3主要由另一種甲基轉移酶EZH2介導，本實驗還檢測了D5 Stat5a對前列腺癌細胞EZH2表達（mRNA）的影響。如結果圖4所示，雖然在無外源D5 Stat5a轉入（對照）的情況下，EZH2亦有一定的表達（這符合EZH2通常在癌細胞表達的現象），但D5 Stat5a的過表達能夠顯著上調EZH2表達水平，是對照細胞EZH2 mRNA水平的2倍以上。

綜上所述，D5 Stat5a確有促進前列腺癌細胞（DU145、PC3）增殖的作用，其分子機制之一是通過刺激EZH2的表達，改變IGFBP-7啟動子區域的組蛋白表觀遺傳學修飾，促進H3K27Me3，從而抑制IGFBP-7基因的表達。結合以前的工作，筆者推測，D5 Stat5a的高表達可能是促進前列腺癌形成的因素之一。有關D5 Stat5a的作用機制，依然存在大量工作需要完成，許多問題有待進一步回答，例如導致EZH2基因表達上調的分子機制如何？D5 Stat5a可否作為未來治療生殖系統腫瘤的靶點？這些都有待進一步深入探討。

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Over-expression of D5 Stat5a induces proliferation of human prostate cancer cells and histone trimethylation of IGFBP-7 promoter region

NIE XiZHANG JieYU ChaoTAN Dunyong
Department of Biochemistry&Immunology,Jishou University College of Medicine,Hu'nan Province,Jishou416000, China

ObjectiveTo clarify the effect of D5 Stat5a on the proliferation of prostate cancer cells and the expression of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP-7).MethodsProstate cancer cells(DU145 and PC3)were randomly divided into four groups:control and three experimental groups.The cells were infected with adenovirus carrying or not carrying(Con)D5 Stat5a cDNA at MOI 10,20 and 30 respectively for 120 min and cultured in the presence of prolactin(50 ng/mL)for further 48 h.The relative viable cell number was determined by MTS assay.Quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR)and Western blot were used to examine the expression of IGFBP-7. Chromatin immunoprecipitation(ChIP)assay was also applied to examine the effect of D5 Stat5a on the trimethylation of histone 3 of IGFBP-7 gene promoter region.ResultsAdenovirus(carrying D5 Stat5a)infection induced proliferation of prostate cancer cells in a dose-dependant manner.Taking PC3 as example,therelative viable cell number was(1.362±0.018)in control cells,while infection with adenovirus carrying D5 Stat5a cDNA at MOI 10,20 or 30 increased the relative vialble cell number to(1.453±0.022)(P＞0.05),(1.649±0.020)(P＜0.05) and(1.829±0.027)(P＜0.05),respectively.qRT-PCR showed that the relative IGFBP-7 mRNA amounts were(0.796± 0.023)and(0.871±0.046)in DU145 and PC3 control cells respectively,however,they decreased to(0.148±0.019)(P＜0.01)and(0.078±0.021)(P＜0.01)in DU145 and PC3 cells infected with virus carrying D5 Stat5a cDNA at MOI 30, respectively.Increased trimethylation on histone 3 lysine 27(H3K27Me3)of IGFBP-7 gene promoter region and downregulated IGFBP-7 expression were also found in prostate cancer cells over-expressing D5 Stat5a including DU145 and PC3 cells.ChIP assay showed that the percentage of immunoprecipitated DNA in control cells and cells infected with D5 Stat5a cDNA adenovirus at MOI 30 were(0.0176±0.0030)%and(0.0650±0.0099)%(P＜0.01)respectively in DU145 cells.Additionally,over-expression of D5 Stat5a up-regulates the expression of EZH2.The relative EZH2 mRNA in control cells and cells(DU145)infected with virus carrying D5 Stat5a at MOI 30 were(0.0033±0.0004)and (0.0160±0.0035)(P＜0.05),respectively.ConclusionD5 Stat5a promotes proliferation of prostate cancer cells through, at least partly,up-regulation of EZH2 expression followed by trimethylation of H3K27(H3K27Me3)and inhibition IGFBP-7 gene expression,which is one of the molecular mechanism of abnormal proliferation of prostate cancer cells.

D5 Stat5a;Prostate cancer cells;Epigenetics;Histone trimethylation;Chromatin immuneprecipitation assay

RQ7；R73［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0007-07

2014-11-24本文編輯：程銘）

國家自然科學基金資助項目（編號81172497，81260396）。

聶璽（1981.8-），女，吉首大學醫學院2014級生物化學與分子生物學專業在讀碩士研究生；研究方向：乳腺癌的分子機制。

［作者簡介］譚敦勇（1958.2-），男，醫學博士，教授，美國心臟病學會會員及美國內分泌學會會員；研究方向：生殖系統腫瘤的分子生物學。