肺表面活性物質(zhì)對(duì)兔胸部撞擊肺損傷中促炎性細(xì)胞因子的影響

王立 吳越 杜萍尹 寧康迪

新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院胸外科，新疆烏魯木齊830002

肺表面活性物質(zhì)對(duì)兔胸部撞擊肺損傷中促炎性細(xì)胞因子的影響

王立 吳越 杜萍尹 寧康迪

新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院胸外科，新疆烏魯木齊830002

目的觀察肺表面活性物質(zhì)（PS）對(duì)兔胸部撞擊肺損傷中促炎性細(xì)胞因子的影響。方法選取新西蘭大白兔113只，垂直撞擊右側(cè)胸部，復(fù)制急性肺損傷模型，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=38）、羊PS組（n=38）和牛PS組（n=37），分別以生理鹽水、自制的羊PS和牛PS行支氣管肺泡灌洗。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定肺泡灌洗液和肺組織勻漿的白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）的含量。結(jié)果按照IL-1、IL-6、TNF-α的順序，肺泡灌洗液中的含量依次為對(duì)照組［（155.10±20.31）、（175.10±22.34）、（89.57±80.55）pg/mL］、羊PS組［（90.62±4.15）、（80.51±4.72）、（46.79±20.61）pg/mL］、牛PS組［（81.49±3.56）、（77.94±3.05）、（52.04±15.97）pg/mL］，肺組織勻漿中的含量依次為對(duì)照組［（305.70±133.65）、（324.70±23.65）、（283.21±50.49）pg/mL］、羊PS組［（182.00± 27.69）、（178.00±21.96）、（150.34±4.88）pg/mL］、牛PS組［（179.20±34.37）、（173.20±24.07）、（145.52±10.95）pg/mL］。與對(duì)照組相比，羊PS組和牛PS組的含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論針對(duì)交通事故致胸部撞擊肺損傷，采用胸部垂直撞擊建立的兔急性肺損傷動(dòng)物模型，分別以羊或牛PS行支氣管肺泡灌洗，皆減少了肺泡灌洗液和肺組織勻漿中的促炎性細(xì)胞因子的含量，對(duì)促炎癥細(xì)胞因子有一定的抑制作用。

肺表面活性物質(zhì)；急性肺損傷；促炎性細(xì)胞因子

胸部撞擊傷是交通事故和高處墜落的常見傷類。常用的急性肺損傷動(dòng)物模型，往往使用油酸或脂多糖建立，和胸部創(chuàng)傷機(jī)制差異較大［1-3］。本研究以垂直撞擊方式建立的兔急性肺損傷動(dòng)物模型，分別以羊和牛肺表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS）行支氣管肺泡灌洗，以生理鹽水灌洗為對(duì)照組，ELISA法比較肺泡灌洗后促炎性細(xì)胞因子的含量，了解PS對(duì)促炎性細(xì)胞因子的影響，為進(jìn)一步應(yīng)用PS治療胸部撞擊肺損傷提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭大白兔由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重（2.250±0.263）kg，雌雄不限，按國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，全組實(shí)驗(yàn)兔健康。

儀器和試劑：自制垂直胸部撞擊固定支架和羊PS。血?dú)夥治鰞x為美國Nova Biomedical血?dú)夥治鰞x，試劑盒為美國Nova Biomedical血?dú)夥治鰞x專用。兔白介素-1（IL-1）、兔白介素-6（IL-6）、兔腫瘤壞死因子（TNF-α）測(cè)定試劑盒為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。牛肺表面活性劑（商品名珂立蘇）：劑型為凍干粉針劑，成分為磷脂、膽固醇、三酰甘油、游離脂肪酸和少量肺表面活性物質(zhì)蛋白（SP-B和SP-C），規(guī)格70 mg/2 mL，由北京雙鶴藥業(yè)生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立使用自行研制的垂直胸部撞擊固定支架，1.5%戊巴比妥鈉1 mL/kg兔耳緣靜脈注射，分別以不同離地高度和質(zhì)量的撞擊物，呼氣末準(zhǔn)靜態(tài)、自由落體的方式垂直撞擊右側(cè)胸部，撞擊部位為右鎖骨中線第四肋間。測(cè)量兔撞擊接觸面積、胸壁凹陷距離、氧分壓和氧合指數(shù)、實(shí)驗(yàn)兔肺病理檢查和肺干濕比，建立垂直胸部撞擊致兔急性肺損傷動(dòng)物模型。

1.2.2 急性肺損傷動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)①動(dòng)脈血氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）≤300 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）；②肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察及肺損傷病理評(píng)分；③肺干重/濕重比值測(cè)定，判斷肺損傷、肺水腫程度。

1.2.3 分組采用隨機(jī)分組，分為對(duì)照組（n=38）、羊PS組（n=38）和牛PS組（n=37），分別以生理鹽水、自制的羊PS和牛PS行支氣管肺泡灌洗。

1.2.4 羊肺表面活性物質(zhì)制備新鮮羊肺用冷生理鹽水多次灌洗，灌洗液進(jìn)行低溫離心，先以1500 r/min離心10 min清除細(xì)胞碎片后，獲取的上清液在40℃下以40 000 r/min再次離心15 min，取得沉淀物為PS。予冷凍干燥，稱重定量后用生理鹽水稀釋到12 g/L濃度冷藏待實(shí)驗(yàn)使用［4-8］。

1.2.5 支氣管肺泡灌洗在動(dòng)物模型建立4 h后實(shí)驗(yàn)兔頭部抬高20°～30°，氣管導(dǎo)管注入左肺濃度為12 g/L的羊PS 15 mL/kg或者相同劑量的牛PS，對(duì)照組左肺注入生理鹽水15 mL/kg，并注入10 mL/kg氧氣，增大潮氣量20%，進(jìn)行機(jī)械通氣1 min后，低位引流灌洗液。動(dòng)物模型建立12 h后處死動(dòng)物，取肺組織做病理檢查以及肺組織勻漿標(biāo)本［8-10］。

1.2.6 肺泡灌洗液及肺組織勻漿中促炎性細(xì)胞因子的含量采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)肺泡灌洗液及肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6的含量。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6。

1.3.2 垂直撞擊指數(shù)初步設(shè)定垂直撞擊指數(shù)（CK）的計(jì)算公式：CK=（M×S×H）/（N×K）［9-10］。M（kg）：撞擊物的質(zhì)量；S（cm）：垂直撞擊距離（離地高度）；H（cm）：兔胸壁凹陷距離；N（kg）：實(shí)驗(yàn)兔質(zhì)量；K（cm2）：撞擊接觸面積。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)兔肺臟器損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)肺傷情分級(jí)按AIS分級(jí)法。于撞擊后14 h，采用統(tǒng)一的股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，進(jìn)行胸部解剖，明確肺的損傷情況。動(dòng)物臟器損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.4 肺干重/濕重比值測(cè)量將左肺標(biāo)本吸去表面液體，分析天平稱肺濕重后，放置在電烤箱（80℃）中烘干，每24小時(shí)稱重，直到重量不變時(shí)得到恒重（肺干重），代入公式，判斷肺水腫程度。計(jì)算公式為：肺干重/濕重比=肺干重/肺濕重×100%。

1.3.5 急性肺損傷病理評(píng)分和肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

右肺組織放入10%中性甲醛溶液固定48 h后，予脫水、包埋、蘇木精伊紅（HE）染色后光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)。采用4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行肺損傷評(píng)分：①肺泡充血；②間隙或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集；③出血；④肺泡間隔增厚或透明膜形成。根據(jù)每項(xiàng)指標(biāo)病變采用0～4分半定量分析，0分：無或極輕微損傷；1分：輕度損傷；2分：中度損傷；3分：重度損傷；4分：極重度損傷。各項(xiàng)評(píng)分的總和為急性肺損傷的病理評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)兔急性肺損傷病理學(xué)表現(xiàn)

雙側(cè)兔肺體積增大實(shí)變，表面有散在的大小不等紅色斑片，部分肺組織有肋骨壓跡，切面為紅色實(shí)樣變，可見紅色泡沫樣液體溢出，充血水腫狀。光鏡下雙側(cè)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔和肺間質(zhì)呈現(xiàn)水腫、滲出、出血、大量粒細(xì)胞浸潤、間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)血流淤滯、白細(xì)胞附壁的表現(xiàn)。

2.2 三組實(shí)驗(yàn)兔肺干濕比、雙肺+胸壁損傷評(píng)分、病理評(píng)分和垂直撞擊指數(shù)比較

對(duì)照組、羊PS組、牛PS組肺干濕比、雙肺+胸壁損傷評(píng)分、病理評(píng)分和垂直撞擊指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組實(shí)驗(yàn)兔肺干濕比、雙肺+胸壁損傷評(píng)分、病理評(píng)分和垂直撞擊指數(shù)比較

注：PS：肺表面活性物質(zhì)

組別只數(shù)肺干濕比雙肺+胸壁損傷評(píng)分（分）病理評(píng)分（分）垂直撞擊指數(shù)對(duì)照組羊PS組牛PS組38 38 37 0.32±0.05 0.27±0.06 0.29±0.03 9.2±1.4 8.9±2.0 10.1±1.1 9±1 7±2 8±2 55±4 60±7 57±6

2.3 三組實(shí)驗(yàn)兔肺泡灌洗液中促炎性細(xì)胞因子水平比較

三組實(shí)驗(yàn)兔肺泡灌洗液中促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6）水平比較：與對(duì)照組相比，羊PS組與牛PS組TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；羊PS組與牛PS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織勻漿中促炎性細(xì)胞因子水平比較

三組實(shí)驗(yàn)兔肺組織勻漿中促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6）水平比較：與對(duì)照組相比，羊PS組與牛PS組TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；羊PS組與牛PS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討論

本研究以垂直撞擊方式建立兔急性肺損傷動(dòng)物模型，分別以羊或牛PS行支氣管肺泡灌洗，以生理鹽水灌洗為對(duì)照組，與對(duì)照組相比，羊PS組和牛PS組的肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-1、IL-6、TNF-α含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與牛PS組相比，羊PS組肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-1、IL-6、TNF-α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針對(duì)交通事故致胸部撞擊肺損傷，采用胸部垂直撞擊建立的兔急性肺損傷動(dòng)物模型，分別以羊或牛PS行支氣管肺泡灌洗，皆減少了肺泡灌洗液和肺組織勻漿中的促炎性細(xì)胞因子的含量，對(duì)促炎癥細(xì)胞因子有一定的抑制作用。

胸部撞擊致急性肺損傷無論是交通事故或高處墜落造成，均較為常見，是肺組織失控性炎性反應(yīng)的結(jié)果［3-6］。促炎癥細(xì)胞因子是由某些非免疫細(xì)胞及免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有較多生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，主要有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、干擾素（IFN）等，參與炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。PS是一種脂蛋白復(fù)合物，覆蓋在哺乳動(dòng)物的肺泡表面，主要作用是減少肺泡表面張力，增加肺順應(yīng)性，改善肺的氣體交換，降低肺水腫和肺不張，還具有免疫作用和減輕炎性反應(yīng)的作用［7-10］。天然（豬、牛等提取）和人工合成的PS制劑已應(yīng)用于臨床，在新生兒呼吸窘迫綜合征（NRDS）和急性肺損傷等疾病的治療作用中發(fā)揮出越來越明顯的作用［8-11］。

對(duì)胸部撞擊肺損傷造成的促炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的呼吸功能損害，如采取適當(dāng)治療措施，用PS對(duì)胸部撞擊肺損傷動(dòng)物模型行肺泡灌洗可降低炎癥因子水平。了解PS對(duì)胸部撞擊肺損傷中促炎性細(xì)胞因子的抑制作用，為研究胸部撞擊致急性肺損傷的發(fā)生機(jī)制創(chuàng)造了條件，可進(jìn)行胸部撞擊致急性肺損傷以及繼發(fā)性炎性反應(yīng)的進(jìn)一步研究［10-14］。但還需要觀察其他促炎/抑炎細(xì)胞因子的變化，延長實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間，進(jìn)一步研究PS對(duì)兔急性肺損傷的影響作用。

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Effect of pulmonary surfactant on pro-inflammatory cytokines in rabbit's lung injury after chest impact

WANG LiWU YueDU PingYIN NingKANG Di
Department of Chest Surgery,Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi830002,China

ObjectiveTo observe the pulmonary surfactant(PS)effects on pro-inflammatory cytokines in rabbit's lung injury after chest impact.MethodsSelection of 113 New Zealand rabbits,vertical impacted on the right chest,replication animal model of acute lung injury,were randomly divided into control group(n=38),PS group of sheep(n=38)and bovine(n=37),respectively lavaged in bronchoalveolar with saline,homemade sheep pulmonary surfactant and bovine pulmonary surfactant.Using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)method for the determination of bronchoalveolar lavage fluid and lung tissue homogenate of interleukin-1(IL-1),interleukin-6(IL-6),tumor necrosis factor(TNF-α) content.ResultsIn accordance with IL-1,IL-6,TNF-α sequence,contents in bronchoalveolar lavage fluid were control group［(155.10±20.31),(175.10±22.34),(89.57±80.55)pg/mL］,the sheep PS group［(90.62±4.15),(80.51±4.72), (46.79±20.61)pg/mL］,the bovine PS group［(81.49±3.56),(77.94±3.05),(52.04±15.97)pg/mL］;content in lung tissue homogenate were control group［(305.70±133.65),(324.70±23.65),(283.21±50.49)pg/mL］,sheep PS group［(182.00± 27.69),(178.00±21.96),(150.34±4.88)pg/mL］,bovine PS group［(179.20±34.37),(173.20±24.07),(145.52±10.95)pg/mL］. Compared with the control group,the content of sheep PS group and bovine PS group were decreased,there were statistically significant differences(P＜0.05).ConclusionAccording to impact lung injury in chest caused by traffic accidents,establish a animal models of acute lung injury with vertical chest impact respectively in the rabbit,bronchoalveolar lavage with sheep or bovine PS,the content of proinflammatory cytokine reduced in bronchoalveolar lavage fluid and lung tissue homogenate,it has a certain degree of inhibition for proinflammatory cells factors.

Pulmonary surfactant;Acute lung injury;Pro-inflammatory cytokines

R655.3［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0014-04

2015-01-02本文編輯：程銘）

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)2012211A039）。

王立（1974.7-），男，碩士，副主任醫(yī)師；研究方向：胸外科，胸部損傷，急性肺損傷。