蒙古族人PCSK9基因E670G多態性與冠心病相關性研究

高宇 王春梅 黃志亮 郝淑夢

1.內蒙古林業總醫院老年病科，內蒙古自治區牙克石022150；2.黑龍江中醫藥大學臨床醫學院，黑龍江哈爾濱150040；3.內蒙古林業總醫院心胸外科，內蒙古自治區牙克石022150

蒙古族人PCSK9基因E670G多態性與冠心病相關性研究

高宇1,2王春梅1黃志亮3郝淑夢1

1.內蒙古林業總醫院老年病科，內蒙古自治區牙克石022150；
2.黑龍江中醫藥大學臨床醫學院，黑龍江哈爾濱150040；
3.內蒙古林業總醫院心胸外科，內蒙古自治區牙克石022150

目的探討PCSK9基因E670G位點多態性與我國蒙古族人群冠心病（CHD）發病的相關性。方法收集2010年10月～2012年10月就診于內蒙古林業總醫院老年病科經冠狀動脈造影（CAG）確診的蒙古族CHD患者60例作為蒙古族CHD組，另選擇無血緣關系的蒙古族健康體檢者60例（蒙古族健康人群組）、60例漢族CHD患者（漢族CHD組）及60例漢族健康人群（漢族健康人群組）作為研究對象。應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術，對PCSK9基因E670G多態性位點的基因型及等位基因進行分析。結果蒙古族CHD組及蒙古族健康人群組的PCSK9基因的3個E670G多態性位點分型結果均符合哈迪溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律。蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組相比突變型雜合子TC、突變型純合子CC基因型分布頻率患CHD的危險度分析OR值分別是野生型純合子TT基因型分布頻率的2.49、2.95倍，差異有統計學意義（P＜0.05）；蒙古族CHD組C等位基因分布頻率明顯高于蒙古族健康人群組（58.0%比47.0%），差異有統計學意義（P＜0.05）；漢族CHD組C等位基因分布頻率略高于漢族健康人群組（51.0%比48.0%），差異無統計學意義（P＞0.05）。結論蒙古族CHD發病率高可能與PCSK9基因的遺傳易感性及E670G多態性位點有關，C等位基因突變增加了患CHD的風險。

蒙古族；冠心病；前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型；多態性；相關性

冠狀動脈性心臟病（coronary heart disease，CHD）是一種嚴重影響我國公眾健康的主要疾病，其中急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是導致CHD患者死亡的常見原因，近年來其發病率及病死率呈逐年上升的趨勢。CHD的發生和發展是一個多因素、多步驟、多基因調節所產生的疾病，包括吸煙、脂質紊亂、種族、環境、遺傳等因素，目前國內外研究發現一些遺傳易感基因多態性與其發病風險密切相關［1-3］。國內外研究表明，前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein cholesterol receptor，LDL-R）及膽固醇酯轉運蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）基因多態性存在人群缺失多態或突變，與CHD的遺傳易感性相關，且具有明顯的種族和地域差異［4-5］。目前國內外研究不同種族PCSK9基因多態性與CHD發病的研究較多，國內已有研究均集中在漢族CHD遺傳易感性與PCSK9基因多態性的關系的研究，而對蒙古族人群的研究尚未見報道。本研究采用內蒙古地區蒙古族集中聚居優勢，對蒙古族群體CHD的遺傳易感性與PCSK9基因多態性的關系進行探討，并與其在漢族人群中的分布進行比較，以期為CHD的發病機制及診療提供基礎理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2010年10月～2012年10月在內蒙古林業總醫院老年病科住院經確診的蒙古族CHD患者60例（蒙古族CHD組）及同族無血緣關系健康人群60例（蒙古族健康人群組），60例漢族CHD患者（漢族CHD組）及同族健康人群60例（漢族健康人群組）。入選標準：①年齡大于18歲而小于75歲；②病程大于6個月；③冠狀動脈造影（CAG）提示主支或主要分支局限性或節段性狹窄大于75%；④心電圖提示大于2個導聯的ST段的壓低或改變；⑤臨床癥狀典型。排除標準：①合并肝腎功能異常；②近期有感染性疾病或甲功異常；③有自身免疫系統疾病；④CAG提示主支或主要分支局限性或節段性狹窄小于30%；⑤臨床無癥狀或心電圖提示無異常改變。所有人員均采用EDTA真空抗凝采血針管抽取晨起空腹外周靜脈血2 mL各做聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術（PCR-RFLP）使用，采血后立即顛倒混勻并轉移到-20℃冰箱中保存。蒙古族及漢族CHD患者120例，其中男76例，女44例，平均年齡（61.6±9.8）歲；蒙古族及漢族健康人群120例，其中男81例，女39例，平均年齡（59.4±7.8）歲；兩組性別構成比、年齡、吸煙史等比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。以上研究對象為排除PCR擴增失敗的樣本。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑及儀器DNA快速提取試劑盒、Biometra擴增儀、TANEN凝膠成像分析儀等均購于上海生物工程有限公司。

1.2.2 外周血DNA的制備取高溫消毒過的2 mL EP管，取2 mL全靜脈血，加入4 mL細胞裂解液，顛倒搖勻，10 000 r/min離心3 min，吸出上清液，保留細胞核沉淀，加入20 μL蛋白酶K溶液，混勻，再加入200 μL GB緩沖液，混勻，56℃水浴10 min，靜置10 min，再加入200 μL無水乙醇，混勻，10 000 r/min離心3 min，吸出上清液，將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，再次12 000 r/min離心3 min，以增加基因組DNA的獲得率。所提取DNA濃度值至0.05 μg/μL，-20℃保存備用。

1.2.3 引物設計①引物設計軟件：Primer Premier 5.0及Oligo 6等生物軟件；②設計引物序列：上游：5＇-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3＇，下游：5＇-TAGGAG TCTTGTCTCATGCCT-3＇，共計160 bp，各0.4 μmol/L。

1.2.4 PCR擴增與基因分型采用PCR-RFLP技術研究PCSK9基因E670G位點多態性。擴增反應流程：94℃預變性10 min，然后95℃變性40 s；62℃退火40 s；72℃延伸40 s，共36個循環后，72℃繼續延伸50 s。PCSK9基因E670G的PCR產物用限制性內切酶進行消化酶切，酶切反應體系總量10 μL，加入10 U E670G限制性內切酶，PCR產物經滅菌蒸餾水7 μL，37℃水浴過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳60 min，電壓100 V，使用凝膠成像分析儀分析結果。PCR擴增產物經酶切后產生3種基因型：純合子型TT（野生型）、純合子型等位基因CC（突變型）、雜合子基因型TC（雜合型）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析處理，通過直接計數法對基因多態性位點的基因型及頻率進行計算，應用LDA及Chromas軟件對PCSK9基因E670G多態性位點分型結果進行Hardy-Weinberg平衡定律測定及測序結果進行分析，等位基因和基因型頻率分布采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義；用OR和95%CI確定PCSK9基因E670G多態性基因型及等位基因頻率與CHD發病的相對危險度。

2 結果

2.1 PCSK9基因E670G多態性檢測結果及測序分析

PCR產物經電泳凝膠成像系統攝影記錄及測序分析結果如圖1、2所示：純合子型TT（野生型），可見430 bp 1個片段；純合子型等位基因CC（突變型），可見260 bp及180 bp 2個片段；雜合子基因型TC（雜合型），可見3個片段，分別為430、260 bp及180 bp。

2.2 兩組患者PCSK9基因多態性Hardy-Weinberg平衡檢測

應用LDA軟件對四組測試對象進行PCSK9基因E670G多態性位點Hardy-Weinberg平衡檢測，結果如表1、2所示，經χ2檢驗，均P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對象來自同一群體，具有較好的代表性。

2.3 四組患者PCSK9基因E670G多態性位點基因型及等位基因頻率檢驗結果比較

蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組PCSK9基因E670G多態性位點TT、CC、TC基因型及T、C等位基因的分布頻率分別是25.0%、38.0%、40.0%、32.0%、35.0%和30.0%、43.0%、53.0%、58.0%、47.0%。經χ2檢驗后，蒙古族CHD組和蒙古族健康人群組基因型及等位基因的分布頻率差異有統計學意義（χ2=9.819，P=0.002；χ2=5.642，P=0.018）。見表3。

漢族CHD組與漢族健康人群組PCSK9基因E670G多態性位點TT、CC、TC基因型及T、C等位基因的分布頻率分別是32.0%、30.0%、30.0%、30.0%、35.0%和37.0%、49.0%、60%、52.0%、48.0%。經χ2檢驗后，漢族CHD組與漢族健康人群組基因型及等位基因的分布頻率差異無統計學意義（χ2=0.527，P= 0.468；χ2=0.254，P=0.614）。見表3。

OR相關性分析結果顯示：蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組PCSK9基因E670G多態位點突變基因型CC患CHD的危險度是野生型TT的2.95倍，而突變等位基因C可比其他等位基因增加1.78倍，差異有統計學意義（P＜0.05），而漢族CHD組與漢族健康人群組間各基因型及等位基因分布頻率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

所以，蒙古族CHD發病率可能與PCSK9基因E670G多態性位點基因型有關，基因突變增加了患CHD的風險，而漢族CHD發病率與PCSK9基因E670G多態性位點基因型及等位基因分布頻率可能無關。

3 討論

CHD因冠脈粥樣硬化等多種原因導致血管管腔狹窄性疾病，是威脅中老年患者健康的主要危險性疾病因素之一。然而，CHD是多因素、多步驟、多基因調節所產生的疾病，特別是單個或多個基因的遺傳易感性作用對CHD發病有直接關系［6-7］。美國一項CHD臨床研究發現，不同的種族及同種族不同的環境地域對CHD的易感性也有明顯的不同［8］。早在20世紀90年代，美國醫學界就PCSK9基因E670G多態性位點是否為CHD的遺傳易感性以及與性別的差異進行過激烈爭論，其中以Saade等［9］為主的大型研究機構認為PCSK9基因E670G多態性位點與CHD的風險相關，而以Werner等［10］和Jelassi等［11］學者的兩項研究顯示無關聯。國內近些年對PCSK9基因也有相關報道，但研究結果也不盡相同，具有代表性的最新報道有廣東省的'艷輝等［12］對該地區漢族人群進行了病例對照研究，還有研究者對四川地區CHD與PCSK9基因E670G多態性進行了相關報道［13］，我國臺灣人Hsu等［14］認為PCSK9基因影響血脂代謝，但并不是CHD的生物標志物。

內蒙古自治區呼倫貝爾市地處祖國最北端，天氣環境條件較為惡劣，除漢族外，蒙古族是人口聚居最多的一個少數民族。本研究結果顯示PCSK9基因E670G多態性位點有3種基因型：純合子型TT（野生型）、純合子型等位基因CC（突變型）、雜合子基因型TC（雜合型）。PCSK9基因E670G多態性位點的基因型和等位基因頻率分布在蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組之間有顯著性差異，突變基因型CC患CHD的危險度是野生型TT的2.95倍，而突變等位基因C可增加1.78倍；表明蒙古族群體PCSK9基因E670G多態性對CHD具有遺傳易感性可能，突變基因型和等位基因頻率分布可能增加了CHD的發生風險。而漢族CHD組與漢族健康人群組研究結果顯示，PCSK9基因E670G多態性與其發病率無相關性，這與國內部分研究結果相悖，造成結果不同的原因可能是該地區漢族人口較少，環境因素及地區差異也可能是導致該結果的原因。

近些年國內外的多項臨床研究發現，PCSK9基因E670G多態性位點位于富含半胱氨酸的C末端，參與對自身催化的調節，若去除該結構域將導致PCSK9的聚集，PCSK9在調節血漿LDL-C水平中具體發揮怎樣的作用仍不明了［15-16］。其機制可能是通過轉錄后機制調節肝臟的LDL-R水平，PCSK9基因過度表達引起肝臟LDL-R的下降，還影響LDL-R介導的LDL-C的攝取，從而影響膽固醇、血漿總膽固醇的水平，導致血漿LDL-C水平升高，所以，PCSK9基因E670G多態性與載脂蛋白、血漿總膽固醇水平等之間存在相關，可作為血漿LDL-C水平及冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度的獨立預測因子，引發CHD發生，并具有劑量效應［17-18］。目前國內外已開始進行Ⅰ期和Ⅱ期藥物實驗，例如，賽諾菲公司研發的SAR236553和羅氏公司研發的RG7652等，可以說為未來降脂藥物的選擇提供了新的空間［19-20］。

本實驗采用PCR-RFLP方法及病例-對照研究分析PCSK9基因的E670G多態性在不同民族CHD患者分布特點，為CHD的預防和個性化治療、遺傳發病機制、危險性分層評估等提供實驗依據。結果顯示，PCSK9基因的E670G多態性可能是蒙古族人群CHD發病的遺傳危險因素之一，突變基因型CC與突變等位基因C可能增CHD發病風險。CHD患者中突變等位基因C攜帶者可能與急性冠脈綜合征相關。由于存在地區、環境、生活習慣、種族等局限，此結論尚需在后續研究中進一步擴大樣本、并采用多種其他分析方法多中心、長期的前瞻性的病例對照研究加以驗證，才能真正確定PCSK9基因E670G多態性是否與CHD發生存在內在的聯系。

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Relationship between E670G polymorphism of PCSK9 gene and susceptibility to coronary heart disease in the Mongolian nationality

GAO Yu1,2WANG Chunmei1HUANG Zhiliang3HAO Shumeng1
1.Department of Geriatrics,Inner Mongolia Forestry General Hospital,Inner Mongolia Autonomous Region,Yakeshi 022150,China;2.Clinical Medicine College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Heilongjiang Province, Harbin150040,China;3.Department of Cardio-Thoracic Surgery,Inner Mongolia Forestry General Hospital,Inner Mongolia Autonomous Region,Yakeshi022150,China

ObjectiveTo explore the relationship between E670G polymorphism of PCSK9 gene and susceptibility to coronary heart disease(CHD)in the Mongolian people.Methods60 healthy Mongolian people(healthy Mongolian people group),60 Han people with CHD(CHD Mongolian people group);60 healthy Han people(healthy Han people group),and 60 Han people with CHD(CHD Han people group)from October 2010 to October 2012 in Inner Mongolia Forestry General Hospital were collected as study objects.The gene polymorphism of E670G in PCSK9 gene of four groups were detected by PCR-RFLP.Three SNPs in E670G polymorphism of PCSK9 gene(TT,TC,CC)were genotyped by the PCR-RFLP,and the differences of allele frequency and genotype between four groups were analyzed.ResultsNo significant deviations from the Hardy-Weinberg equilibrium were observed in these three SNPs genotypes in E670G polymorphism of PCSK9 gene(TT,TC,CC)in CHD and healthy peoples(P＜0.05).The distribution frequency of PCSK9-E670G genotypes was significant differences of frequencies were found in genotypes TT,TC and CC between CHD Mongolian people group and healthy Mongolian people group(P＜0.05).The risks of TC and CC for CHD were 2.49 and 2.95 folds respectively to TT genotype,the difference was statistically significant(P＜0.05).The distribution frequency of allele C in the CHD Mongolian people group(58.0%)was statistically higherthan that of the healthy Mongolian people group(47.0%),the difference was statistically significant(P＜0.05);the distribution frequency of allele C in CHD Han people group was higher than the healthy Han people group(51.0%vs48.0%),but there was no statistically significant difference between two groups(P＞0.05).ConclusionGene polymorphism of PCSK9 genotypes may be associated with the risk of Coronary heart disease in the Mongolian nationality but not in Han nationality.The mutation of PCSK9 gene may increase the incidence of CHD in the Mongolian nationality.

The Mongolian nationality;CHD;PCSK9;Polymorphism;Correlation

R541.4［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0018-05

2014-12-12本文編輯：任念）

內蒙古民族大學科學研究項目（編號NMD1349）。

高宇（1980-），女，內蒙古牙克石人，黑龍江中醫藥大學臨床醫學專業2013級在讀碩士研究生；研究方向：心血管病基礎與臨床研究。

［作者簡介］王春梅（1956-），女，內蒙古牙克石人，碩士生導師；研究方向：心血管病的基因診斷與治療。