Notch信號通路及其在卵巢癌細胞中的作用

熊愛為，謝靜燕

(南京醫科大學附屬南京醫院 南京市第一醫院婦科，江蘇 南京 210006)

【婦幼綜合研究】

Notch信號通路及其在卵巢癌細胞中的作用

熊愛為，謝靜燕

(南京醫科大學附屬南京醫院 南京市第一醫院婦科，江蘇 南京 210006)

Notch是一條進化上高度保守的跨膜受體家族，通過對Notch信號通路下游胞內活性成分(NICD)的激活來促進卵巢癌細胞的增殖和分化，影響細胞耐藥特性。Notch通過與不同配體結合，在不同細胞環境中發揮不同作用，提示其通路活化的多樣性。該文主要對Notch信號通路通過不同配體結合激活NICD而發揮不同的作用進行綜述。

Notch信號通路；卵巢癌；增殖；分化

卵巢癌是嚴重威脅女性健康的疾病，病死率位于婦科腫瘤首位。卵巢癌有70%發現時已處于晚期，且Ⅲ期或Ⅳ期的5年生存率仍維持在20%～40%之間。目前對卵巢癌的經典治療方案仍為手術加術后化療，而以鉑類與紫杉醇為基礎的化療方案術后復發率高是導致卵巢癌患者5年生存率低的重要原因。據研究，19%的早期卵巢癌及60%～85%的晚期卵巢癌會復發。近來發現，Notch在卵巢惡性細胞中異常表達，Notch信號通路下游分子參與到了卵巢癌細胞對鉑類或者紫杉醇類化療藥物耐藥、卵巢癌細胞增殖及凋亡等過程[1-3]，提示其與卵巢癌的發生發展可能相關。

Notch是一個高度保守的跨膜受體家族，廣泛存在于無脊椎和脊椎動物體內。1917年Morgan在果蠅體內發現Notch基因，因其突變可致果蠅殘翅(Notch ES)得名。近年來研究表明Notch通路廣泛存在于卵巢癌、胰腺癌、直腸癌等惡性腫瘤組織細胞中[4]，當Notch通路發生障礙，會發生遺傳性多發梗死綜合征、自身免疫性疾病、T細胞白血病等。有研究證實Notch通路在卵巢癌細胞增殖等方面發揮重要作用[5]。

1 Notch信號通路及其經典激活方式

哺乳動物有4個同源Notch受體Notch 1～4和5個配體Dll1、Dll3、Dll4、Serrate樣配體Jagged-1和Jagged-2。一般認為，Notch信號轉導通路是進化上高度保守的一條通路，Notch受體通過與臨近細胞的結合發揮作用。Notch跨膜蛋白一般包括富含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)樣重復區域的胞外區、跨膜區、可作用于轉錄激活因子(CRT-binding factor 1，CBF-1)的胞內區。經典的Notch通路亦稱轉錄激活因子/Notch信號通路轉錄調控蛋白(recombination signal binding protein J kappa，RBP-Jk)依賴途徑。Notch先是以異二聚體的形式與臨近的配體Dll1、Dll3、Dll4及Jagged-1和Jagged-2相結合，隨后被金屬蛋白酶家族及解聚素剪切釋放于胞外，一旦被釋放，Notch蛋白的胞外區域被細胞以胞飲的形式內吞，隨即以此為起點的下級偶聯發揮作用，在γ-分泌酶的剪切下，下游Notch胞內活性成分(Notch intracellular domain，NICD)形成，并刺激下游CBF-1的高表達，繼而形成CBF-1/RBP-Jk抑制因子復合物，特異性與DNA序列“GGTGGGAA”相結合，通過招募輔抑因子維甲酸/甲狀腺受體沉默因子(silencing mediator of retinoid acid and thyroid hormone receptor，SMRT)、Ⅰ/Ⅱ型組蛋白去乙?；傅鹊鞍仔纬晒惨种茝秃衔?，抑制下游基因轉錄，如影響細胞周期蛋白cyclin D1、c-myc等的表達，進而影響細胞增殖、分化[6-7]，見圖1。

2 Notch信號通路在卵巢癌細胞中的異常表達

WANG等[1]研究發現，Notch1、Notch3受體及其配體Dll4與Jagged-1在卵巢癌組織中表達明顯高于正常組織，且發現Dll4在卵巢癌組織中表達相比于交界性及正常組織具有高度差異和獨立性，且認為其與微血管密度(microvessel density，MVB)相關。Jung等[2]研究發現，相比于卵巢良性增生性病變，Notch3受體在卵巢漿液腺及透明細胞癌中表達顯著升高，差別具有統計學意義；而其配體Jagged-1及Jagged-2升高不明顯，無統計學差異。Rahman等[8]用免疫組化分析了111例卵巢癌組織中Notch3的表達情況，發現61例(55%)在胞核或胞漿中陽性表達，而正常卵巢組織中無Notch3的表達；進一步研究發現，與正常卵巢細胞相比，卵巢癌細胞中Notch3基因的擴增現象定位于染色體19p13.12，提示其與腫瘤發生可能相關，熒光定量PCR及熒光原位雜交技術(fluorescent in situ hybridization，FISH)水平均證實Notch3基因DNA及mRNA轉錄水平的擴增與Notch3在卵巢癌細胞19號染色體上的擴增具有顯著相關性[3]。

注：鄰近細胞配體結合到相鄰細胞Notch跨膜蛋白的膜外區域，通過兩次蛋白水解形成Notch細胞內活性區域(NICD)，NICD定位于細胞核后通過與CBF1結合來調節不同基因，包括HES-1、核轉錄因子κB(nuclear factor κappa B，NF-κB)等。

圖1 Notch信號通路

Fig.1 Notch signaling pathway

3 Notch信號通路在卵巢癌細胞中的作用

3.1 Notch1受體及Notch2受體

3.1.1 Notch1受體單獨刺激下游轉錄因子進而影響細胞增殖

在Notch1高表達的細胞中常發現HES-1(hairy enhancer of split 1)或其他下游因子的高表達，如前列腺惡性細胞疾病、神經內分泌腫瘤及卵巢癌細胞，但不能說明Notch1能直接刺激轉錄因子HES-1進而影響細胞增殖、分化。Notch2或者音猬因子(sonic hedgehog，SHH)也可通過HES-1發揮作用，當Notch1活性區域NICDI穩定轉染A2780細胞后，A2780細胞株的48小時細胞活力高于對照組127%、72小時的活力高于對照組72%[9]，提示Notch1可單獨刺激下游HES-1信號通路來刺激細胞活力[10]。Drenzek等[11]用黃腐酚抑制Notch1信號同路上CBF-1與下游轉錄基因的結合，熒光素酶報告基因驗證抑制效果后，蛋白質印記法(western bolt，WB)結果提示p21WAF1/CIP1在黃腐酚干擾后的SKOV3及OVCAR3顯著升高，并表現出一定的劑量依賴性；進一步探索發現干擾后的SKOV3及OVCAR3細胞S期及G2/M期細胞比例明顯增加，磷酸化周期素依賴激酶2(phospho-cdc2 Tyr15，CDC2)檢測確認了黃腐酚干擾后卵巢癌細胞通過捕獲S期及G2/M期細胞抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。

3.1.2 Notch1胞內活性區域的促細胞增殖作用

Notch1胞外區在卵巢惡性腫瘤細胞及正常細胞中表達無明顯差異，而胞內活性區NICD的表達具有明顯差異。Rose等[12]的研究表明，NICD在卵巢癌細胞OVCAR3、SKOV3、CAOV3中均相較于對照組高表達，且發現在乳頭狀腺癌的患者中，NICD表達的比例占76%；NICD的表達還與卵巢癌的臨床分期相關，NICD表達隨著卵巢癌臨床分期的嚴重而呈上升趨勢；當干擾RNA沉默NICD后，細胞增殖實驗(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)證實NICD在促進卵巢癌細胞的增殖中發揮了重要作用。Groeneweg等[13]進一步研究發現，隨著Notch家族配體(Delta、Serrate、Lag3、DSL-family)與Notch受體的結合，在腫瘤壞死因子α轉化酶(tumor necrosis factor-a-converting enzyme，TACE)作用下，卵巢腺癌細胞胞內NICD通過與Notch信號通路轉錄輔助激活蛋白(mastermind-like factors，MAML)及轉錄輔酶A(transcriptional coactivators，CoA)結合形成下游轉錄復合物，進而依靠HES與斷裂基因4轉導蛋白樣增強子(transducin-like enhancer of split，TSL)的協同作用促進細胞增殖。

3.1.3 Notch1受體具有部分抑癌基因作用

Notch1及Notch2主要存在于細胞質中，免疫組化染色結果表明Notch1在細胞中的異位情況隨著細胞惡性程度的增高而呈下降趨勢，Notch1在漿液性囊腺瘤及黏液性囊腺瘤中陽性率分別為50%和33.3%，其中13%及33.3%為明顯胞內異位(+++)，而交界性腫瘤的陽性率則為20%；Notch2在卵巢惡性腫瘤、交界性、良性組織中陽性率分別為97%、100%、83%[14]。由此可見，Notch1可能具有某些抑癌基因的作用，而Notch2在卵巢惡性細胞、交界性、良性細胞中均高表達，3種細胞之間表達差異無統計學意義，提示Notch2在卵巢癌細胞的增殖中可能存在作用而與卵巢癌的發生機制無明顯關系。

3.1.4 Notch1受體信號通路對卵巢癌細胞耐藥性及細胞凋亡的作用

WANG等[15]研究發現，用間接抑制Notch活性的γ-分泌酶抑制劑{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT}抑制Notch信號通路后，可通過調節下游細胞周期因子cyclin B1、Bcl-2及Caspase-3，捕捉處于G2期的卵巢癌細胞來降低細胞耐藥性，并促進卵巢癌細胞凋亡。該研究還發現，聯合使用DAPT及順鉑處理卵巢癌耐藥細胞可得到不同結果：DAPT處理后再予順鉑處理，卵巢癌耐藥細胞可使二者拮抗卵巢癌細胞的作用增強，而順序相反則無明顯抗卵巢癌耐藥細胞作用，與此同時，Groeneweg等[13]發現，用γ分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor，GSI)處理卵巢癌細胞后，可提高2/3卵巢癌細胞對鉑類藥物敏感性(P<0.05)，且GSI聯合紫杉醇可使卵巢癌細胞對化療藥物敏感性大于二者單獨使用，有趣的是，使用GSI后似乎并不影響傳統環磷酰胺聯合順鉑化療方案療效[13，15-16]。

3.2 Notch3受體

3.2.1 Notch3可以通過非核轉錄因子通路調節細胞增殖

Jagged-1配體是卵巢癌細胞中最常見的配體，研究表明其通過調節血管形成調節腫瘤進展及微環境，對Jagged-1配體沉默后發現細胞的黏附和生長能力有顯著降低[16]。Park等[17]研究表明，Jagged-1的激活有賴于Notch3通路的激活，Notch3胞內活性片段上調后可激活Jagged-1，而單向敲除Jagged-1后，對Notch3的影響不明顯，由此表明，Notch3不但通過經典NF-κB通路調節細胞增殖分化，還可激活Jagged-1配體活化細胞。

3.2.2 Notch3及其下游胞內活性區域對卵巢癌細胞分化及轉移中的作用

Rahman等[8]發現Notch3陽性卵巢癌細胞用RNA干擾后，細胞增殖活力明顯低于Notch3陰性細胞，提示Notch3對于卵巢癌細胞具有增殖促進作用。Jung等[2]研究結果提示，Notch3在卵巢癌細胞及卵巢正常細胞中陽性率分別為78%(45/58)、24%(5/21)，差別具有統計學意義，而Notch3下游活性因子NICD在所有卵巢細胞中均有表達，卵巢惡性細胞與正常細胞表達水平分別為1.64±0.19(/103)、0.98±0.2(/103)，差別有統計學意義(t=4.216，P<0.05)；卵巢癌細胞中低分化與中高分化、Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌組織中NICD的表達具有明顯差異，而卵巢癌的病理類型、手術-病理分期以及是否行放化療與NICD的表達無關[2，6]，提示Notch3對卵巢癌細胞的增殖特別是分化及轉移具有明顯促進作用。

3.3 Notch4受體

目前對Notch4受體通路在卵巢癌細胞中作用的研究較少，僅有研究表明其可能與卵巢癌細胞增殖[6]有關，并有可能作為卵巢癌干細胞潛在表面分子標志[18]。

4 討論

Notch1及Notch2對卵巢癌細胞具有明顯促進增殖作用，而Notch1具有某些抑癌基因作用，同時Notch1及Notch2對于卵巢癌細胞發生機制無明顯相關性；Notch3可通過非經典NF-κB途徑調節卵巢癌細胞增殖、分化，對卵巢癌細胞分化及臨床轉移具有明顯促進作用。

順鉑和卡鉑類藥物通過損傷DNA復制、轉錄最終導致細胞凋亡，Notch信號通路抑制劑GSI抑制Notch下游因子后，組蛋白γ-H2AX中心點的氧化磷酸化反應揭示抑制后DNA損傷作用[19]，猜想GSI可增加耐藥細胞株對于鉑類藥物的敏感性，其機制可能與增加DNA損傷作用、捕獲處于G2/M期卵巢癌細胞、促進細胞凋亡有關，提示GSI可能作為克服鉑類化療藥耐藥問題的有效途徑。

有趣的是，在Notch受體信號通路激活方面，有研究者發現用GSI抑制Notch通路后，細胞增殖抑制作用無明顯變化[20]，可能存在兩種可能，①Notch下游通路激活非經典Notch通路依賴性；②Notch受體可能存在持續性激活特點導致GSI作用后無明顯變化。同時發現，當miR-128、miR-215/625或miR-502-5p等低表達與PPARG、RUNX1和CCND1基因高表達后，卵巢癌患者的生存率明顯下降，提示某些基因表型修飾后有可能通過miRNA結合mRNA3'端非翻譯區，進而結合下游細胞因子轉錄水平啟動子區域激活Notch通路[21]，而當用FSH刺激細胞后，Notch通路的激活提示Notch通路活化的多樣性[22]，這都提示Notch通路激活具體機制及調控細胞周期機制需進一步研究。

[1]Wang H, Huang X, Zhang J,etal. The expression of VEGF and Dll4/Notch pathway molecules in ovarian cancer[J]. Clin Chim Acta, 2014, 436: 243-248.

[2]Jung S G, Kwon Y D, Song J A,etal. Prognostic significance of Notch 3 gene expression in ovarian serous carcinoma[J]. Cancer Sci, 2010, 101(9): 1977-1983.

[3]Hu W, Liu T, Ivan C,etal. Notch3 pathway alterations in ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2014, 74(12): 3282-3293.

[4]Güng?r C, Zander H, Effenberger K E,etal. Notch signaling activated by replication stress-induced expression of midkine drives epithelial-mesenchymal transition and chemoresistance in pancreatic cancer[J]. Cancer Res, 2011, 71(14): 5009-5019.

[5]Allam H, Aoki K, Benigno B B,etal. Glycomic analysis of membrane glycoproteins with bisecting glycosylation from ovarian cancer tissues reveals novel structures and functions[J]. J Proteome Res, 2015, 14(1): 434-446.

[6]Rose S L. Notch signaling pathway in ovarian cancer[J]. Int J Gynecol Cancer, 2009, 19(4): 564-566.

[7]Liu J, Deutsch U, Jeong J,etal. Constitutive notch signaling in adult transgenic mice inhibits bFGF-induced angiogenesis and blocks ovarian follicle development[J]. Genesis, 2014, 52(9): 809-816.

[8]Rahman M T, Nakayama K, Rahman M,etal. Notch3 overexpression as potential therapeutic target in advanced stage chemoresistant ovarian cancer[J]. Am J Clin Pathol, 2012, 138(4): 535-544.

[9]Ingram W J, McCue K I, Tran T H,etal. Sonic Hedgehog regulates Hes1 through a novel mechanism that is independent of canonical Notch pathway signalling[J]. Oncogene, 2008, 27(10): 1489-1500.

[10]Mirandola L, Chiriva-Internati M, Montagna D,etal. Notch1 regulates chemotaxis and proliferation by controlling the CC-chemokine receptors 5 and 9 in T cell acute lymphoblastic leukaemia[J]. J Pathol, 2012, 226(5): 713-722.

[11]Drenzek J G, Seiler N L, Jaskula-Sztul R,etal. Xanthohumol decreases Notch1 expression and cell growth by cell cycle arrest and induction of apoptosis in epithelial ovarian cancer cell lines[J]. Gynecol Oncol, 2011, 122(2): 396-401.

[12]Rose S L, Kunnimalaiyaan M, Drenzek J,etal. Notch 1 signaling is active in ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 2010, 117(1): 130-133.

[13]Groeneweg J W, DiGloria C M, Yuan J,etal. Inhibition of notch signaling in combination with Paclitaxel reduces platinum-resistant ovarian tumor growth[J]. Front Oncol, 2014, 4: 171.

[14]Platonova N, Manzo T, Mirandola L,etal. PI3K/AKT signaling inhibits NOTCH1 lysosome-mediated degradation[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2015, [Epub ahead of print].

[15]Wang M, Ma X, Wang J,etal. Pretreatment with the γ-secretase inhibitor DAPT sensitizes drug-resistant ovarian cancer cells to cisplatin by downregulation of Notch signaling[J]. Int J Oncol, 2014, 44(4): 1401-1409.

[16]Jung J G, Stoeck A, Guan B,etal. Notch3 interactome analysis identified WWP2 as a negative regulator of Notch3 signaling in ovarian cancer[J]. PLoS Genet, 2014, 10(10): e1004751.

[17]Park J T, Chen X, Tropè C G,etal. Notch3 overexpression is related to the recurrence of ovarian cancer and confers resistance to carboplatin[J]. Am J Pathol, 2010, 177(3): 1087-1094.

[18]Gao M Q, Choi Y P, Kang S,etal. CD24+cells from hierarchically organized ovarian cancer are enriched in cancer stem cells[J]. Oncogene, 2010, 29(18): 2672-2680.

[19]McAuliffe S M, Morgan S L, Wyant G A,etal. Targeting Notch, a key pathway for ovarian cancer stem cells, sensitizes tumors to platinum therapy[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(43): E2939-E2948.

[20]Shah M M, Zerlin M, Li B Y,etal. The role of Notch and gamma-secretase inhibition in an ovarian cancer model[J]. Anticancer Res, 2013, 33(3): 801-808.

[21]Ivan C, Hu W, Bottsford-Miller J,etal. Epigenetic analysis of the Notch superfamily in high-grade serous ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 2013, 128(3): 506-511.

[22]Zhang C P, Yang J L, Zhang J,etal. Notch signaling is involved in ovarian follicle development by regulating granulosa cell proliferation[J]. Endocrinology, 2011, 152(6): 2437-2447.

[專業責任編輯：安瑞芳]

Notch signaling pathway and its role in ovarian cancer cells

XIONG Ai-wei, XIE Jing-yan

(DepartmentofGynaecology,NanjingFirstHospital,NanjingMedicalUniversity,JiangsuNanjing210006,China)

Notch is a evolutionarily conserved transmembrane receptor family, which accelerates the proliferation and differentiation of ovarian cancer cells by activating Notch intracellular domain (NICD) at lower part of Notch signaling pathway and thus affects drug resistance characteristics. Combined with different ligand binding, Notch plays different roles in different cellular environment, which indicates the variety of pathway activation. This review focused on the effect of Notch signaling pathway to activate NICD by combining different ligand binding.

Notch signaling pathway；ovarian cancer；proliferation；differentiation

2015-02-01

國家自然科學基金資助項目(No.81572557)

熊愛為(1989-)，男，在讀碩士研究生，主要從事婦科惡性腫瘤的研究。

謝靜燕，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.071

R737.31

A

1673-5293(2015)05-1100-03