蜂膠抗病原微生物的活性物質及其作用機制

曹雪萍　申小閣　胡福良

（浙江大學動物科學學院，杭州310058）

蜂膠抗病原微生物的活性物質及其作用機制

曹雪萍申小閣胡福良

（浙江大學動物科學學院，杭州310058）

抗病原微生物作用是蜂膠最重要的生物學活性之一。蜂膠抗病原微生物的活性物質及其作用機制是蜂膠抗病原微生物活性研究的熱點。本文對近十多年來蜂膠抗病原微生物的活性物質，以及蜂膠在破壞菌體細胞膜及細胞壁的完整性、抑制細菌生物膜形成、抑制細菌毒力因子活性和其相關基因表達等作用機制的相關研究進展進行綜述，以期為蜂膠抗病原微生物活性的進一步研究及開發利用提供參考。

蜂膠；抗病原微生物；活性物質；作用機制

蜂膠的化學成分極為復雜，生物學活性十分廣泛，其中抗病原微生物作用是蜂膠最重要的生物學活性之一。蜂膠抗病原微生物活性的研究與應用的歷史十分悠久。近十多年來，隨著人們對蜂膠關注度的逐漸升高，大量圍繞蜂膠抗病原微生物活性的相關研究也隨之展開，其中蜂膠抗病原微生物的活性物質及其作用機制是研究的熱點。本文對近十多年來蜂膠抗病原微生物的活性物質及其作用機制的相關研究進展進行綜述，以期為蜂膠抗病原微生物活性的進一步研究及開發利用提供參考。

1　蜂膠抗病原微生物的活性物質

蜂膠成分極為復雜，并且針對不同種類的微生物，其發揮活性的主要成分也有所差異。關于蜂膠中具有抗微生物作用的活性物質研究有很多，主要以抗菌活性成分的研究為主。這些活性成分種類眾多，包括黃酮類、萜烯類和酚酸類等。

喬智勝和陳瑞華［1］對河南蜂膠抗菌活性成分進行了研究，從蜂膠乙醇浸提液中分離到3個具有抗菌活性的結晶，經鑒定分別為芥子酸、異阿魏酸和咖啡酸，從醇提液中還分離得到白楊素。蜂膠中含有多種抑制金葡菌生長的成分，然而單體成分的最小抑菌濃度（MIC）與蜂膠本身相近或略高，說明蜂膠對金葡菌的抗菌作用是多種成分協同作用的結果。

Amoros等［2］通過實驗確定了蜂膠中抗1型單純皰疹病毒的主要黃酮性成分，并發現黃酮醇的活性要強于黃酮的活性，活性順序為高良姜素＞山奈酚＞槲皮素，表明這些抗病毒成分之間還存在協同作用，后來Lyu等［3］的實驗也進一步證實了Amoros等的結論，并發現受試的黃酮類成分對1型單純皰疹病毒的作用強于對2型單純皰疹病毒的作用

Velikova等［4］從巴西本地的一種無刺蜂（Melipona quadrifasciata）采集的蜂膠中分離出3種貝殼杉烯，而其中異貝殼杉烯酸與蜂膠總提取液具有相近的抗金葡菌的能力，說明這種物質在巴西無刺蜂蜂膠的抗菌活性中起到非常重要的作用。

Bosio等［5］從意大利西北部的不同地區采集到兩種蜂膠樣，用46種化膿性鏈球菌菌株檢測其抗微生物活性。通過瓊脂稀釋法和瓊脂擴散法，得到MIC和最小殺菌濃度（MBC）不超過234 μg/ml，其中的一種蜂膠抗菌作用更好，HPLC分析發現這個樣品提取物中含有更多的黃酮類成分松屬素和高良姜素。Koo等［6］研究了蜂膠組分對變形鏈球菌生長和葡糖基轉移酶（GTFs）活性的影響，通過評估蜂膠中已發現的幾種不同化學組分對溶液中和唾液包被的羥基磷灰石珠子表面的葡糖基轉移酶活性的影響。結果表明，黃酮和黃酮醇是溶液中葡糖基轉移酶強有力的抑制物，而對不可溶性酶則效果較差。芹黃素（4，5，7-三羥基黃酮的一種）是最有效的GTFs抑制物，無論是在溶液中（濃度為135 μg/ml時達到90.5～95%抑制）還是在sHA珠子表面（135 μg/ml時達到30～60%）；通過MIC、MBC和Time-kill研究抗菌活性，結果表明，黃烷酮類和一些二氫黃酮醇以及倍半萜烯tt-法尼醇能抑制變形鏈球菌和血鏈球菌的生長，tt-法尼醇是最有效的抗菌成分，其MIC和MBC分別為14～28 μg/ml和56～112 μg/ml。

Kartal等［7］對土耳其安納托利亞喀山和馬爾馬里斯地區蜂膠樣品的抗菌活性進行了評估，研究表明其抗菌活性主要與蜂膠中的咖啡酸及其脂類有關，并從喀山蜂膠樣中分離出了包含3，3-二甲基咖啡酸烯丙酯和3-異戊烯咖啡酸酯兩個同分異構體混合物，這個混合物具有良好的抗菌活性。Popova等［8］的實驗表明酚類黃酮類物質對蜂膠發揮抗菌作用的重要性，因為總黃酮和總酚含量低的樣品，其所需抗菌濃度會偏大，只有其中一種樣品比較特殊，可能是其內含有的二萜酸幫助其發揮了抗菌活性。

de Paula等［9］研究了產自巴西的蜂膠乙醇提取物（EEP）和單體成分對16種口腔致病微生物的抗微生物活性，發現所有受試微生物都會受到EEP的影響，但沒有哪一種單體成分的活性強于提取物，表明蜂膠抗微生物的作用是各種物質的協同作用。Gonsales等［10］研究表明，EEP能有效抑制革蘭氏陽性菌，而且抗菌能力與黃酮含量呈正相關。Melliou等［11］（2007）研究表明蜂膠揮發油中含有的萜類物質具有很好的抗菌和抗真菌活性。Campana等［12］分析了兩種EEP和幾種黃酮成分對臨床分離的16種人空腸彎曲桿菌和幾種革蘭氏陽性及陰性病原菌的抗菌活性。結果表明，EEP能抑制空腸彎曲桿菌、糞腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，活性最強的黃酮類成分是高良姜素；空腸彎曲桿菌對其敏感度達到68.8%，槲皮素的活性稍差（50%）；EEP對人空腸彎曲桿菌的MIC為0.3125～0.156 mg/ml，高良姜素和槲皮素的MIC為0.250～0.125 mg/ml。

Trusheva等［13］從伊朗蜂膠中分離出5種單體成分，其中4種為萜脂：bornylp-hydroxybenzoate、bornylvanillate、ferutinolp-hydroxybenzoate和ferutinol vanillate，均具有抗金黃色葡萄球菌的活性。這些抗菌成分屬于苯甲酸類單萜和倍半萜烯脂類物質。

Ordónez等［14］研究了從阿根廷北部采集的蜂膠對一些植物病原菌的抗菌活性。結果表明，活性最強的蜂膠來自圖庫曼省，并從中分離出抗菌活性成分2.4-二羥基查耳酮，其抗菌作用比EEP還有效（MIC分別為0.5～1.0 μg/ml和9.5～15.0 μg/ml）。植物毒性試驗結果表明，蜂膠提取物不會延遲萵苣種子的發芽和洋蔥根的生長；蜂膠溶液噴灑在感染了丁香假單胞菌的西紅柿上能降低病壞程度，表明蜂膠在防治水果病害上可能很有前景。

de Aguiar等［15］評估了3種巴西蜂膠提取物對瘤胃內一些細菌的作用，發現蜂膠提取物能抑制一些細菌的生長，但也有一些微生物對蜂膠提取物表現為耐受，被抑制的細菌對蜂膠提取物的敏感性不同，酚含量最低的提取物抗菌活性也最差。通過對蜂膠提取物中主要酚類化合物柚皮素、柯因、咖啡酸、p-香豆酸和阿替匹林C對4個敏感菌株抗菌活性的評估，發現只有柚皮素對所有菌株表現出抑制活性，表明柚皮素是參與蜂膠抗菌作用的重要成分之一。Navarro-Navarro等［16］通過肉湯宏稀釋法對墨西哥西北部索諾蘭沙漠3個不同地區的蜂膠抗弧菌屬抗菌活性的研究，發現產自烏雷斯地區蜂膠的抗菌活性最強，對大多數受試菌的半數最低抑菌濃度（MIC50）小于50 μg/ml，而且呈濃度依賴性。該蜂膠成分中的高良姜素和咖啡酸苯乙酯具有強烈抑制細菌生長的活性，MIC50為0.05～0.10 mmol/L。

由此可見，蜂膠中含有多種已經證實的抗病原微生物成分，如松屬素、高良姜素、山奈酚、槲皮素、芹黃素、咖啡酸苯乙酯、柚皮素、異阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、苯甲酸類單萜和倍半萜烯脂類物質等。此外，還有文獻報道了蜂膠中其他具有抗病原微生物作用的成分：球松素、楊芽黃素、對香豆苯酸酯、短葉松素、白楊素、靛紅山姜素短葉松黃烷酮、喬松酮、柯因以及某些蜂膠中特有的活性成分，如巴西綠蜂膠中的3-異戊二烯基-4-羥基肉桂酸、2，2-二甲基-6-羧乙基香豆素、3，5-二異戊二烯基-4-羥基肉桂酸（阿替匹林C）、2，2-二甲基-6-羧乙基-8-異戊二烯基香豆素等［17，18］。

2　蜂膠抗病原微生物的機制

蜂膠的抗菌活性雖然很早便被人們發現，但在早期，其抗菌作用的確切機制一直不清楚，只是簡單地將其歸結為各種物質的協同作用。近年來，隨著研究的不斷深入，對蜂膠抗菌機制的探索有了初步的進展。蜂膠抗病原微生物的機制有以下幾方面：

2.1抑制細菌生物膜形成，影響細菌的生長和黏附

朱明等［19］研究了不同濃度新疆黑蜂膠對大腸桿菌體外培養生物膜形成及清除的影響，結果表明，新疆黑蜂膠醇提物對大腸桿菌的MIC為12.50 g/L，當濃度為6.25 g/L時新疆黑蜂膠就可在早期呈劑量依賴性干擾細菌生物膜的形成，當濃度達到50.00 g/L時，其抑制生物膜的作用與慶大霉素無顯著差異；當蜂膠濃度達12.50 g/L時，能有效清除成熟生物膜，而當濃度達到50.00 g/L時，其清除成熟BF的作用與慶大霉素無顯著差異。

Wojtyczka等［20］利用表皮葡萄球菌研究波蘭蜂膠的抗菌活性，結果表明，波蘭蜂膠乙醇提取物在濃度為0.39～1.56 mg/ml時能抑制此菌的所有受試菌株的生物膜形成；EEPP的MIC范圍為0.78～1.56 mg/ml，平均MIC為1.13±0.39 mg/ml。然而，EEPP濃度為0.025～0.39 mg/ml時，經過12 h和24 h的孵育，反而能促進此菌的增殖。總的結果分析表明，EEPP的抗菌活性表現為細菌生長的抑制，生物膜形成能力的抑制，以及增殖的強度明顯受到孵育時間、EEPP濃度以及這些因素之間相互作用的影響。

Koo等［21］研究發現，蜂膠中的黃酮和黃酮醇能有效抑制變形鏈球菌葡糖基轉移酶活性，其中芹黃素最為有效。蔡爽等［22］采用紙片瓊脂擴散法觀察了10、25、50和100 g/L蜂膠防齲涂膜對變形鏈球菌c型和d型的抑菌作用，結果表明各濃度蜂膠涂膜及基質都能夠抑制細菌生長和黏附，且抑菌作用呈明顯的濃度依賴性，100 g/L涂膜組的抑菌效果與1.6 g/L洗必泰溶液無顯著性差異。

Scazzocchio等［23］研究了EEP亞抑菌濃度的抗菌活性及其對一些抗生素抗菌作用的影響，還研究了EEP亞抑菌濃度對金黃色葡萄球菌一些重要的毒力因子，如脂肪酶、凝固酶的作用，以及對其生物膜形成的影響。結果表明，EEP對所有受試的臨床菌株都有很好的抗微生物活性。而且，EEP能大大增強一些抗菌藥物如氨芐西林、萬古霉素、頭孢曲松等的作用，但不能增強紅霉素的作用，而同樣的EEP濃度能抑制一些葡萄球菌的脂肪酶活性和凝固酶活性和生物膜的形成。

張秀喜［24］的研究表明，蜂膠可使金黃色葡萄球菌和大腸桿菌堿性磷酸酶和β-半乳糖酸酶在胞外溶出，且對金黃色葡萄球菌的作用比大腸桿菌的要強，其抑菌機理表現為使細菌細胞壁和細胞膜的通透性增大。

2.2破壞菌體細胞膜及細胞壁的完整性，使細菌內容物外流

Tim和Lamb［25］通過比較金黃色葡萄球菌細菌懸濁液中鉀流失狀況，以研究高良姜素對細菌細胞膜完整性的影響。結果表明，高良姜素、抑菌抗生素新生霉素和青霉素G對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus NCTC 6571）的MIC分別為50 μg/ml、62.5 ng/ml和31.3 ng/ml，當5×107cfu/ml的金黃色葡萄球菌在包含50 μg/ml的高良姜素的無鉀培養介質中12 h后，細菌活力下降了60倍。1×109cfu/ml的金黃色葡萄球菌在含有50 μg/ml的高良姜素條件下孵育12 h后，比空白組多流失了21%的鉀；新生霉素并不會造成鉀流失，而細菌孵育在含有31.3 ng/ml的青霉素G培養介質中會有6%的鉀流失。這些數據表明，高良姜素造成的鉀流失可能是由于它對細菌細胞膜造成直接損傷或通過自溶作用造成間接損傷，即損傷細胞壁以及接下來的滲透性溶解。

2.3抑制細菌毒力因子活性和其相關基因的表達，使其侵襲力和毒力下降

姜游帥［26］研究了蜂膠對金黃色葡萄球菌毒力因子抑制作用，結果表明蜂膠能抑制金黃色葡萄球菌ATCC29213生長，MIC為512 μg/ml，并且亞抑菌濃度蜂膠能降低金葡菌溶血活力和凝固酶效價，降低金葡菌腸毒素A、腸毒素B及α-溶血素表達量；在基因水平上，亞抑菌濃度蜂膠能減少α-溶血素基因hla和Agr二元調控系統的agrA mRNA表達量，而Agr二元調控系統對金葡菌對數生長后期分泌的許多毒力蛋白有調控作用，對α-溶血素起到正向調控的作用。因此，預測蜂膠降低α-溶血素的表達部分依賴于抑制Agr二元調控系統。

3　研究展望

盡管蜂膠抗病原微生物機理上的研究已經取得一定進展，但研究還是偏少且不夠深入。蜂膠化學成分復雜，其抗菌機理也必然多樣，所以很值得進行更深入的研究。

蜂膠中豐富的黃酮及萜烯類物質對抗菌活性的發揮起到很大的作用，而黃酮及萜烯類物質的抗菌機制主要存在以下幾種［27］：（1）損傷細菌細胞質膜；（2）抑制細菌核酸合成；（3）干擾細菌的能量代謝；（4）抑制細菌細胞壁的形成；（5）抑制細菌細胞膜的形成。這些研究對蜂膠抗菌機制的深入研究有一定的參考意義。然而需要注意的是，由于一些實驗設計的不合理，或對實驗數據、實驗現象理解的不當，一些實驗結論可能需要進一步驗證。例如，黃酮的抗菌機制到底是一種還是多種存在爭議，因為機制研究實驗中，存在將原因與結果混淆的可能。例如，抗菌成分損傷了菌體細胞膜，會擾亂質子動力勢，而這會進一步影響ATP產生和物質轉運。如果菌體細胞產生能力和攝取營養物質的能力受到影響，緊接著便會影響其核酸、肽聚糖等合成的能力，這種情況下，單一的作用機制有可能被誤解為多種作用機制。蜂膠作為一種成分極為復雜的混合物，不同的成分其抗菌機制可能不同，有些成分由于結構的相似性，也可能具有相同的抗菌機制，所以對其抗菌機制的研究最好能建立在對其單體抗菌成分的研究之上，進一步研究蜂膠及其成分究竟是通過以上所提到的一種還是多種機制發揮抗菌作用的。

此外，值得注意的是，關于蜂膠的抗菌研究，大多研究結果表明其對革蘭氏陽性菌的作用強于對革蘭氏陰性菌的作用，具體機制尚不是特別清楚。可能是革蘭氏陰性菌復雜的外膜結構不利于蜂膠進入胞內發揮作用，也有可能是于一些革蘭氏陰性菌特殊的耐藥機制，如主動外排系統［28］。有文獻表明存在于革蘭氏陰性菌細胞膜的外排泵系統AcrAB-TolC（存在于腸科桿菌）及MexAB-OprM（存在于綠膿桿菌）與革蘭氏陰性菌對大多數植物成分耐受有一定關系［29］。而大腸桿菌及綠膿桿菌等陰性菌對蜂膠比較耐受的機理可能與此有很大的關系，有待進一步研究。

［1］喬智勝，陳瑞華.河南蜂膠抗菌活性成分的研究［J］.中國中藥雜志，1991，16（8）：481-482.

［2］Amoros M，Simoes CMO，Girre L，et al.Synergistic effect of flavones and flavonols against herpes simplex virus type 1 in cell culture.Comparison with the antiviral activity of propolis［J］.J Nat Pro，1992，55（12）：1732-1740.

［3］Lyu SY，Rhim JY，Park WB.Antiherpetic activities of flavonoids against herpes simplex virus type 1（HSV-1）and type 2（HSV-2）in vitro［J］.Archives Pharmacal Res，2005，28（11）：1293-1301.

［4］Velikova M，Bankova V，Tsvetkova I，et al.Antibacterial entkaurene from Brazilian propolis of native stingless bees［J］.Fitoterapia，2002，71（6）：693-696.

［5］Bosio K，Avanzin C，D'Avolio A，et al.In vitro activity of propolis against Streptococcus pyogenes［J］.Lett Appl Microbiol，2000，31（2）：174-177.

［6］Koo H，Rosalen PL，Cury JA，et al.Effects of compounds found in propolis on Streptococcus mutansgrowth and on glucosyltransferase activity［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46（5）：1302-1309.

［7］Kartal M，YildizS，Kaya S，et al.Antimicrobial activity of propolis samples from two different regions of Anatolia［J］.J Ethnopharmacol，2002，86（1）：69-73.

［8］Popova M，Silici S，Kaftanoglu O，et al.Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition［J］.Phytomedicine，2005，12（3）：221-228.

［9］de Paula AMB，Gomes RT，Santiago WK，et al.Susceptibility of oral pathogenic bacteria and fungi to brazilian green propolis extract［J］.Pharmacol online，2006，3：467-473.

［10］Gonsales GZ，Orsi RO，Fernandes Júnior A，et al.Antibacterial activity of propolis collected in different regions of Brazil［J］.J Venom Anim Toxins，2006，12（2）：276-284.

［11］Melliou E，Stratis E，Chinou I.Volatile constituents of propolis from various regions of Greece-Antimicrobial activity［J］.Food Chem，2007，103（2）：375-380.

［12］Campana R，PatroneV，Franzin ITM，et al.Antimicrobial activity of two propolis samples against human Campylobacter jejuni［J］. J Med Food，2009，12（5）：1050-1056

［13］Trusheva B，Todorov I，Ninova M，et al.Antibacterial monoand sesquiterpene esters of benzoic acids from Iranian propolis［J］. Chem Cent J，2010，4：8.

［14］Ordónez RM，Zampini IC，Nieva Moreno MI，et al.Potential application of Northern Argentine propolis to control some phytopathogenic bacteria［J］.Microbiol Res，2011，166（7）：578-584.

［15］de Aguiar SC，Zeoula LM，Franco SL，et al.Antimicrobial activity of Brazilian propolis extracts against rumen bacteria in vitro［J］.World J Microb Biotech，2013，29（10）：1951-1959.

［16］Navarro-Navarro M，Ruiz-Bustos P，Valencia D，et al.Antibacterial activity of Sonoran propolis and some of its constituents against clinically significant Vibrio species［J］.Foodborne Pathogens and Disease，2013，10（2）：150-158.

［17］黃文誠.蜂膠中的抗菌和抗腫瘤成分-阿替匹林［J］.蜜蜂雜志，2002，（4）：7-8.

［18］楊書珍，彭麗桃，姚曉琳，等.蜂膠抗真菌作用研究進展［J］.食品工業科技，2009，30（11）：349-352.

［19］朱明，徐琦，吳曄華，等.新疆黑蜂膠體外抑制大腸桿菌生物膜的研究［J］.中國醫藥導報，2013，10（36）：18-21.

［20］Wojtyczka RD，Kepa M，Idzik D，et al.In vitro antimicrobial activity of ethanolic extract of Polish propolis against biofilm forming Staphylococcus epidermidis Strains［J］.eCAM，2013，Article ID 590703.

［21］Koo H，Rosalen PL，Cury JA，et al.Effect of a new variety of Apis melliferapropolis on Mutans streptococci［J］.Curr Microbiol，2000，41（3）：192-196.

［22］蔡爽，時清，李玉晶，等.蜂膠涂膜對變形鏈球菌生長和黏附的抑制作用［J］.實用口腔醫學雜志，2006，22（2）：171-174.

［23］Scazzocchio F，D'Auria FD，Alessandrini D，et al.Multifactorial aspects of antimicrobial activity of propolis［J］.Microbiol Res，2006，161（4）：327-333

［24］張秀喜.蜂膠黃酮的提取及提取物的抑菌、抗氧化活性研究［D］.合肥：合肥工業大學碩士學位論文，2009.

［25］Tim Cushnie TP，Lamb AJ.Detection of galangin-induced cytoplasmic membrane damage in Staphylococcus aureus by measuring potassium loss［J］.J Ethnopharmacol，2005，101（1-3）：243-248.

［26］姜游帥.蜂膠對金黃色葡萄球菌毒力因子抑制作用研究［D］.大慶：黑龍江八一農墾大學碩士學位論文，2010.

［27］Tim Cushniea TP，Lamb AJ.Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids［J］.Int J Antimicrob A-gents，2011，38（2）：99-107.

［28］Savoia D.Plant-derived antimicrobial compounds：alternatives to antibiotics［J］.Future Microb，2012，7（8）：979-990.

［29］Kuete V，Alibert-Franco S，Eyong KO，et al.Antibacterial activity of some natural products against bacteria expressing a ultidrug-resistant phenotype［J］.Int J Antimicrob Agents，2011，37（2）：156-161.

國家蜂產業技術體系專項資金（CARS-45），上海市科技興農重點攻關項目［（2014）第6-1-1號］

胡福良，E-mail：flhu@zju.edu.cn