興奮性氨基酸及其受體與轉運體在抗癲癇藥理學研究中的意義

廖玉芳，岳建農，王淋麗，李 飛，李 娜，鄒 澤（重慶市黔江中心醫院藥學部，重慶 409099）

癲癇是一組以腦功能陣發性、暫時性紊亂為特征的綜合征，反復發作且不可預測發病時間，為中樞神經系統（CNS）常見慢性病之一[1]。近年，有關癲癇病理過程及治療方法的研究均有較大進步。其病因學機制目前比較認同的是“失衡”假說，即細胞外以興奮性氨基酸（EAA）為代表的興奮性遞質功能增強，或以抑制性氨基酸（IAA）為代表的抑制性遞質的功能減弱，導致突觸傳遞增強，致使神經元過度興奮而出現細胞群異常放電，從而誘發癲癇的發生發展[2]。為了闡明與EAA相關的癲癇病因學機制，筆者以“Excitatory amino acids”“Receptor”“Transporter”“Epilepsy”等為關鍵詞，在PubMed數據庫中檢索2004－2014 年的相關文獻。共得到文獻150 余條，對其中40條有效文獻歸納總結后就EAA、興奮性氨基酸受體（EAARs）、興奮性氨基酸轉運體（EAATs）與癲癇發生發展的關系以及在抗癲癇藥理研究中的意義作如下綜述。

1 EAA在癲癇發生發展過程中的病理生理學意義

癲癇發病機制與興奮/抑制功能失衡有關。神經系統中的EAA 與IAA 類神經遞質的失衡與癲癇發作有密切聯系，它們及其各自受體異常都能引起神經元異常放電，導致神經微環路出現紊亂，最終誘發癲癇。EAA 主要包括谷氨酸（Glutamate，Glu）和天冬氨酸（Aspartame acid，Asp）；IAA 主要包括γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）、甘氨酸（Glycine，Gly）、牛磺酸（Taurine，Tau）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）及α-氨基羥甲基唑丙酸（AMPA）等。在哺乳動物CNS 中，EAA是含量最多、作用最強的興奮性神經遞質，主要貯存于突觸前神經末梢，通過突觸前Ca2+依賴型電壓門控通道釋放，作用于突觸后膜的EAARs[3]。EAA在CNS中參與了包括從快速突觸傳遞到形成復雜的信號處理過程，如學習、記憶以及對傷害的反應等。

EAA 水平異常升高與癲癇患者的過度興奮有著密切聯系。細胞內外Glu 大量堆積所導致的神經細胞過度興奮是癲癇發作的生理基礎，EAA對癇性放電過程的誘導、擴散及延遲起著主要作用[4]。癲癇發作時EAA/IAA比值增大、Glu和Asp水平升高、大腦皮質和海馬內的Glu免疫陽性反應神經元細胞數量增多[5-6]；海馬區的GABA、Tau、NMDA及AMPA含量降低，神經元發生凋亡。這可能與EEA 引起的興奮性毒性有關[7]。由于癲癇發作時神經元長時間處于過度興奮狀態，據報道中央顳葉性癲癇（MTLE）發作時海馬齒狀的全細胞電流明顯增強[8]，同時觀察到癲癇患者神經細胞外Glu 水平有不同程度的升高[9]。另有研究通過微量透析方式比較顳葉性癲癇（TLE）患者的硬化海馬與非硬化海馬細胞外Glu水平，發現發病前和發病時硬化海馬細胞外Glu 水平有所提高，尤其是在硬化海馬區，且發病后細胞外Glu仍會維持在較高水平，反映出這些神經元過度興奮與高水平Glu的依賴性[10]。因此，下調Glu水平已成抗癲癇治療中的重要研究方向。

2 EAATs在癲癇發生發展過程中的生理特性及生理學意義

細胞外缺乏EAA代謝系統，EAA的滅活主要依賴EAATs的攝取，進入細胞后在EAA 滅活酶作用下被滅活。在這個過程中，EAATs起著關鍵作用，根據轉運體的底物特異性和動力學特性，目前已經確定的EAATs 有5 種亞型，即EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4 和EAAT5[11]。EAATs 亞 型 之 間 有50%～60%的同源性，且EAATs 與來自于相同基因家族的ASC轉運體間具有30%～40%的同源性[12]。EAATs是一種位于細胞膜上的糖蛋白。在CNS 中，神經元細胞膜和膠質細胞膜上都含有EAATs，而在EAATs亞型中EAAT1和EAAT2是主要的神經膠質細胞轉運體，參與了前腦內超過90%的Glu的攝取[13]；并且EAAT2 還參與了腦內以及突觸中Glu 的攝取，攝取Glu 是EAAT2 的主要生理作用[14]。此外，還有EAAT3、EAAT4神經元轉運體以及主要分布于視網膜上的EAAT5，它們均發揮著不同程度的攝取轉運Glu的作用。

EAA的轉運異常會致使突觸間隙內的EAA迅速聚集，不斷激活EAARs。過度激活EAARs 可促使神經元受到病理損害，并導致一系列神經性紊亂。EAA 的攝取是借助EAATs 利用跨膜電化學梯度作為驅動力進行的，運轉由鈉、鉀、氫氧根的離子梯度驅動力的推動進行的。Glu的再攝取速率很高，通過Glu同離子梯度的偶聯作用，EAAT1能夠逆1 000倍的濃度差轉運Glu，Glu 經轉運體再攝取進入星形細胞后迅速轉化為無興奮活性的谷氨酰胺[15]。一旦再攝取受抑制，如當癲癇發作時，離子梯度或膜效能降低，EAATs 則通過鈣依賴方式將Glu運出并釋放到胞外間隙中，使胞外Glu 大量蓄積，從而過度激活谷氨酸受體（GluRs），引起興奮毒性，加重癲癇發作[16]。

EAATs低表達與癲癇發生密切相關。敲除EAAT2的大鼠腦切片顯示，細胞外Glu 含量增加并出現自發性癲癇，由此確定了EAATs 的功能缺失與癲癇的因果關系；在癲癇模型動物中還顯示出EAAT1 和谷氨酸轉運體1（GLT-1）mRNA 和蛋白質水平的降低，但EAAT3 變化不明顯[17]。人體試驗的報道不多見，僅有少量有關癲癇轉運體的報道[18]。通過原位雜交和Western blot 技術對TLE 患者海馬和顳葉皮質的EAAT1 和GLT-1 表達的研究顯示，同正常對照組比沒有發現EAAT1 和GLT-1 mRNA 和蛋白表達增加，卻觀察到神經元缺失區的EAAT3表達增加[19]。對海馬硬化和海馬非硬化及正常對照組的比較研究時觀察到硬化海馬中EAAT1-IR 和GLT-1-IR明顯減少，同時伴有這2種運轉體的mRNA水平的降低；而在海馬硬化組的對應區域中（顆粒細胞層和菌絲層）觀察到神經元EAAT3蛋白水平的升高[20]。免疫組化和定量Western blot的研究沒有發現MTLE與非MTLE在GLT-1表達上存在差異[21]。

中樞神經紊亂與EAATs 對Glu 的吸收能力降低或潛在的功能障礙及EAATs表達下調有密切聯系[22]。多種退行性神經性疾病，如癲癇、肌萎縮、阿爾茨海默病、帕金森綜合征等均與Glu運轉紊亂有關。

3 EAARs在癲癇研究中的重要意義

L-Glu是最豐富的興奮性神經遞質，介導哺乳動物體內主要的興奮途徑，通常也被稱為EAA，應答于L-Glu 的受體稱為EAARs[23]。EAARs 分為兩大類：一類為離子型受體（iGluRs），包括N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）、海人藻酸受體（KAR）和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑受體（AMPAR），它們與離子通道偶聯，形成受體-離子通道復合物，介導快信號傳遞；另一類為代謝型受體（mGluRs），與膜內G 蛋白偶聯，這些受體被激活后通過G 蛋白效應酶、腦內第二信使等組成的信號轉導系統起作用，產生較緩慢的生理反應[24]。生理狀態下，EAARs僅會處于短暫的激活狀態；而在某些病理條件下，不適當地刺激EAARs會以興奮毒性的方式導致神經元細胞損傷或缺失[25]。

興奮毒性與多種神經性病變的病理生理學有關，包括阿爾茨海默病、舞蹈病、肌萎縮性側索硬化、癲癇、焦慮癥等。其中癲癇被看作是EAA 能突觸傳遞過量所引起的神經紊亂，給予大量Glu 或iGluRs 激活劑時可誘發癲癇模型動物驚厥發作并引起大腦皮層及海馬組織切片的癲癇樣改變[26]。由于Glu能神經信號在癲癇病理生理學中具有重要意義，早期有關癲癇治療的嘗試都是針對iGluRs 展開的，并且發現較多iGluRs阻滯藥在很多動物模型中能有效緩解癲癇發作，但這些藥物有著包括運動、認知障礙等多種副作用而未能成功應用于臨床[27]。隨著mGluRs 的發現，針對GluRs 的癲癇治療方案重新受到人們的關注。mGluRs 的一個優點在于它們不負責傳遞快速突觸反應，在突觸釋放中也很少處于活化狀態[28]。mGluRs出現在外部被激活的區域并起到調節作用，并且僅在神經元被高度活化的條件下才表現出活性[29]。此外，鑒于mGluRs的G蛋白和第二信使的本質，其能比iGluRs產生更持久的效應[30]。由于mGluRs被活化后，仍能夠調節Glu釋放，使得mGluRs成為值得關注的治療靶點。

mGluRs是G蛋白偶聯受體，迄今已克隆出8個亞型，分別命名為mGluR1～mGluR8。根據氨基酸序列的同源性、信號轉導機制及生理特性，將mGluRs 分為三類[31]：第一類包含mGluR1和mGluR5；第二類包含mGluR2和mGluR3；第三類包含mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8。組內mGluR的氨基酸序列約有70%的同源性，不同組間僅有45%的同源性。許多試驗表明，第三類mGluRs的活性主要表現為興奮性神經毒性，與癲癇的啟動、傳播、維持及遲發性神經元死亡有關。海馬內注射高劑量或體循環給予第一類mGluRs 激動藥均可以導致大鼠驚厥發作及海馬CA1、CA3區錐體細胞丟失[32]。第一類mGluRs 激動藥誘發癲癇的可能機制為：（1）激活磷酸脂酶C、促使磷酸肌醇水解、促進細胞內Ca2+釋放、增加胞漿內Ca2+濃度，導致突觸后的興奮性毒性損傷；增加突觸前Glu釋放，引起突觸間隙的Glu 累積，導致癲癇發作。（2）通過調節第一類mGluR 活動，增強NMDA 的毒性作用。（3）促進癲癇發生相關的蛋白和一氧化氮合成。第一類mGluRs 阻滯藥具有一定的調節痙攣、抗驚厥的作用，但由于它們會長時程阻滯小腦運動功能，導致運動功能障礙，故限制了第一類mGluRs 阻滯藥的開發潛力[33]。

激動第二類mGluRs可產生抗癲癇作用。第二類mGluRs激動藥可顯著提高癲癇發作閾值，有效抑制癲癇發作程度，作用機制與抑制神經元去極化導致的Glu 釋放有關。第二類mGluRs激動藥可作為過度活躍的Glu能突觸前膜的選擇性抑制藥，并用于抗癲癇研究。在活化區域外出現第二類mGluRs則可能需要更高的Glu 濃度，如癲癇發作中的受體活化過程。因此，第二類mGluRs 激動藥不易阻滯必要的突觸傳遞，而對于各型癲癇均顯示出確切的治療潛力，使得第二類mGluRs成為最有開發潛力的靶點，然而目前發現的有活性的第二類mGluRs激動藥都不理想。在單純激動藥研究遇到困難時，研究者把mGluRs 的調節藥作為重要研究對象，合成的mGluR2的正變構調節藥，只有在mGluR2激活藥或Glu存在時才能發揮調節作用，并對mGluR2 有特異性[34]。當突觸與mGluR2 正變構調節藥結合后，mGluR2功能增強，阻止癲癇發作。此外，mGluR2 除可作為癲癇調節靶點外，還與其他CNS 疾病相關，如焦慮、帕金森病和疼痛等[35]。

激活第三類mGluRs 后通過阻滯持續活化區持續性的突觸活動，在藥理作用上可減輕癲癇大發作，但對小發作不僅無效反而會加重發作程度。由于缺乏第三類mGluRs 特異激動藥，使得目前仍無法全面評估其效能。研究還發現，第三類mGluRs激動藥可增加皮層神經元自發性活動，可能干擾對因皮層神經元過度興奮引起的疾病的治療。顯然，還有待于開發高選擇性的mGluRs 激動藥和阻滯藥以便我們更深入地研究mGluRs。

4 EAATs對癲癇治療和新藥開發的指導意義

癲癇治療仍以控制癲癇發作為主要目標。由于此病具有長期性、反復性等特征，多數患者需終身服藥，治療的目標仍在于減少或防止癲癇發作。據不完全統計，仍有20%～25%的患者難以用藥物控制其反復發作。因此，在控制癲癇發作的同時控制癲癇敏感性的形成，使得降低難治性癲癇發作次數并最終完全控制成為可能。

對CNS中EAATs的研究始于20世紀80年代，早期研究主要通過定量測定轉運體轉運同位素標記底物的能力，確定了Na+-K+依賴性轉運體的動力學特性。而近年的研究則集中在高選擇性轉運體抑制劑的研發上。現有轉運體抑制劑皆屬于α-氨基酸類，其α-羧基與第2個酸性基團間通常隔有2～4個碳原子。目前，通過對幾種含有3～5 個環結構的Glu 類似物的合成和藥理學研究，發現了系列有價值的新型高效的EAAT1抑制劑，包括L-CCG-Ⅲ、L-反式-2，4-PDC、反式-ACBD和L-抗式-吲哚-MPDC[36]。這些抑制劑由于構象變化小，所以對轉運體的選擇性明顯提高，與傳統抑制劑相比，它與GluRs 幾乎沒有交叉反應，從而顯著降低了興奮毒性對神經元的損傷。

早期研究發現轉運體抑制劑能增強EAA 的神經毒性癥狀，長期應用轉運體抑制劑時，可誘發運動神經元病變[37]。由此可以看出，研究轉運體功能的異常與癲癇發病機制的關系具有十分重要的意義。在未來，對轉運體亞型選擇性強效抑制劑的開發是一個主要目標，盡管一些已知的化合物如海人藻酸、L-α-氨基乙酸等提供了有關提高特異性的思路，但是還需要明確現有轉運體與CNS中觀察到的轉運體的轉運特性之間的關系。但隨著強選擇性抑制劑的出現使得觀察CNS各轉運體亞型在維持Glu的正常傳遞、保護神經元免受Glu毒性影響中的作用變得更加方便。

體液中一些細胞因子和生長因子可以調節或修飾EAAT1的功能。細胞培養發現蛋白激酶C可以增強EAAT2和EAAT3的活性[38]。此外，一些外源性物質，如乙醇可以增強EAAT3的功能，β-內酰胺類抗生素可以增加GLT1蛋白的表達和功能、促進對Glu的攝取，該過程中蛋白激酶C和磷脂酰激酶3發揮了重要作用[39]。Glu 合成酶水平的下調會影響EAAT2 蛋白表達的水平，而通過這些方法可降低細胞間隙Glu、Asp 含量，使得神經元免受興奮性毒性的損害，從而控制癲癇的反復發作，這為研制抗癲癇藥物提供了嶄新的思路和依據[40]。

5 結語

EAATs 和第二類mGluRs 可能對癲癇的治療提供了新的思路，并為研制理想治療藥物提供了有益的靶標。可以設想，如果將作用于第二類mGluRs 和EAATs 的藥物、調節第二類mGluRs 和EAATs 的基因或者影響相應蛋白表達的藥物應用于臨床，將對癲癇的防治發揮積極的作用。然而第二類mGluRs 和EAATs 在癲癇發生及其敏感性形成中的機制還不十分清楚，有待于進一步對癲癇發生及發展的細胞和分子機制的深入研究。

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