阻斷Hedgehog通路可抑制骨肉瘤mg63細胞的生長

陳 軍呂 智*

（1 山西醫科大學，山西 太原 030001；2 山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001）

阻斷Hedgehog通路可抑制骨肉瘤mg63細胞的生長

陳 軍1呂 智2*

（1 山西醫科大學，山西 太原 030001；2 山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001）

目的 研究Hedgehog通路特異性阻斷藥物環靶明（cyclopamine）對人骨肉瘤細胞株mg63增殖與凋亡的影響。方法 MTT法檢測環靶明對骨肉瘤mg63細胞增殖的抑制作用，流式細胞術檢測細胞凋亡，PT-PCR檢測環靶明處理前后Gli1、PTCH1 mRNA的表達量的變化。結果 環靶明抑制mg63細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性。經5、10、20 μmol/L的環靶明處理48 h后，骨肉瘤mg63細胞的凋亡率逐漸增高，明顯高于對照組的凋亡率（P＜0.01）。Gli1、PTCH1mRNA在mg63中的表達實驗組均低于對照組。結論 Hedgehog通路特異性阻斷藥物環靶明能夠抑制骨肉瘤mg63細胞的增殖，促進其凋亡。

骨肉瘤；細胞增殖；細胞凋亡；環靶明

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的骨惡性原發腫瘤，是骨骼系統最常見的原發惡性腫瘤。隨著保肢手術的開展及新輔助化療的應用，患者5年生存率提高到66%～75%［1-2］。但是近年來骨肉瘤的治療處于平臺期。Hedgehog（Hh）通路在人類胚胎的發育過程中起著重要的作用，與眾多腫瘤的發生發展存在重要聯系。Hh通路特異性阻斷藥物能夠抑制由Hh通路引起的細胞反應。環靶明能與Hh通路下游分子SMO特異性結合，從而阻斷Hh通路。本實驗通過環靶明體外特異性阻斷骨肉瘤mg63細胞中Hh通路的傳導，觀察對骨肉瘤細胞增殖及凋亡的影響，旨在為骨肉瘤的臨床治療提供依據。

1　材料與方法

1.1材料、試劑和儀器：骨肉瘤mg63細胞購于中科院上海生物細胞研究所。環靶明購于美國LC Laboratories公司。DMEM和胎牛血清購于武漢博士德公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）購自于美國Sigama公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自于北京四正柏公司。Trizol mRNA提取試劑盒購于美國Invitrogen公司。

1.2細胞培養及處理：人骨肉瘤細胞系mg63置于37 ℃、5%CO2培養箱培養。空白組，對照組，5 μmol/L環靶明組，10 μmol/L環靶明。培養48 h后檢測。

1.3RT-PCR檢測：收集處理48 h后各組細胞，Trizol法提取總mRNA。轉錄成cDNA。Gli1上游引物5-GAGATCCCACATCCTCACT-3，下游引物5-ACTTGCCAACCAGCATGCC-3，PTCH上游引物5-ATTCAACCAAACCTCTTGA-3，下游引物5-GAGTCATTAACTGGAACA-3。取cDNA及內參18S引物各2 μL進行PCR反應，計算各組ΔCt值。以公式N=2-ΔΔCt進行相對定量分析。

1.4MTT法檢測mg63細胞增殖：實驗組分別加入2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L環靶明（無水乙醇稀釋），對照組加入等體積無水乙醇，每孔設5個副孔，48 h后MTT法測490 nm處吸光度值。另一96孔板，每孔加入10 μmol/L環靶明作用，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 d后進行MTT檢測，記錄各孔490 nm波長處吸光度值。重復3次。

1.5流式細胞術檢測mg63細胞凋亡：每孔接種1×105個細胞。培養24 h，實驗組加入5.0、10.0、20.0 μmol/L環靶明作用，對照組加入等體積無水乙醇，空白組加入等體積培養液。48 h后，AnnexinV/ PI雙染色測定細胞凋亡。

1.6統計學處理：應用SPSS17.0軟件處理，計量數據以（）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2　結 果

2.1RT-PCR：RT-PCR的檢測結果顯示，在骨肉瘤mg63細胞中Gli1、PTCH1均有表達，并且在環靶明濃度5.0和10.0 μmol/L的組中Gli1和PTCH1的mRNA表達均有下調。以18S作為內參，擴增Gli1和PTCH1基因，每組設3個副孔。5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的環靶明組和對照組進行比較。結果顯示環靶明組的Gli1和PTCH1基因的相對表達量均低于對照組（P＜0.05）。

2.2MTT：實驗結果顯示環靶明對mg63細胞有明顯的抑制增殖的作用，并有一定的濃度依賴性，統計學分析顯示，實驗組與對照組差異有統計學意義（P＜0.01）。其中在5.0～20.0 μmol/L處抑制明顯。10.0 μmol/L環靶明作用mg63細胞，隨著環靶明作用時間的延長，mg63細胞的增殖能力明顯下降，與對照組和空白組差異有統計學意義（P＜0.01），環靶明不同作用時間組之間差異也有統計學意義（P＜0.05）。對照組和空白組對mg63細胞增殖的作用不明顯，二者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3流式：隨著環靶明濃度的增加，骨肉瘤mg63細胞凋亡率提高。環靶明作用48 h后，5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、20.0 μmol/L組的細胞凋亡率分別為（6.56±0.78）%、（12.76±1.3）%、（25.63± 2.3）%，對照組細胞凋亡率為（1.32±1.2）%，組間差異有統計學意義（P＜0.01）。

3　討 論

Hedgehog信號通路參與人類胚胎發育和胚胎形成及后期細胞分化和生長過程。于1980年由Nüsslein-Volhard C和Wieschaus E在果蠅中首先發現。其主要傳導過程可概括為Hedgehog-PTCH1-SMO-Gli。近年來發現，Hh通路與腫瘤的發生發展有重要的關系。其中Gli1的活化被認為是Hh通路激活的標志。在眾多腫瘤的研究中學者們發現，Hedgehog通路特異性阻斷劑環靶明能夠抑制Hh通路的激活，降低Gli1的表達。其主要機制可能是環靶明能夠特異性結合SMO，使之失活，阻斷了Hedgehog通路的傳遞，使Gli1不能活化。本實驗以骨肉瘤mg63細胞為研究對象，通過環靶明干預mg63細胞的生長，來研究阻斷Hedgehog通路對骨肉瘤mg63細胞增殖和凋亡的影響，為骨肉瘤的臨床治療提供依據。

本實驗發現，Hedgehog通路在骨肉瘤mg63細胞中呈激活狀態。RT-PCR顯示PTCH1和SMO在骨肉瘤mg63細胞中高表達。因此作者認為，使用Hedgehog通路特異性阻斷劑環靶明能夠達到抑制骨肉瘤mg63細胞增殖，促進其凋亡的效果。本實驗發現，環靶明作用骨肉瘤mg63細胞的生長過程，RT-PCR檢測發現能夠降低PTCH1和Gli1的mRNA表達。MTT檢測發現，環靶明作用48h后，實驗組的細胞抑制率明顯增高。10.0 μmol/L環靶明作用mg63細胞，腫瘤細胞的抑制可見有明顯的時間相關性。流式細胞術檢測發現，隨著藥物濃度的提高，骨肉瘤mg63細胞的凋亡率明顯增高。上述結果提示，Hedgehog通路在骨肉瘤細胞的增殖中起到維持作用，阻斷該通路，可以抑制骨肉瘤mg63細胞的增殖。

對于Hedgehog通路怎樣導致腫瘤發生及如何維持腫瘤增殖的機制至今仍未完全闡明。但是本實驗研究證明，通過阻斷該通路，可以抑制骨肉瘤mg63細胞的增殖，促進其凋亡。至于其機制，仍需對其下游基因及與Hedgehog通路相交互的其他通路做進一步的研究。本實驗證實，特異性的抑制Hedgehog通路可以達到治療骨肉瘤的目的。對于骨肉瘤的生物靶向治療提供了依據。

［1］Link MP，Goorin AM，Miser AW，et al.The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity［J］.N Engl J Med，1986，314（25）：1600-1606.

［2］Meyers PA1，Heller G，Healey J，et al.Chemotherapy for nonmetastatic osteogenic sarcoma： the Memorial Sloan-Kettering experience［J］.Clin Oncol，1992，10（1）：5-15.

R738.1

B

1671-8194（2015）012-0043-02

山西省實驗動物專項資金（項目編號：2013k01）