大鼠自體動脈血腦出血模型的改良

大鼠自體動脈血腦出血模型的改良

韓偉一陳濤利1陶英群2

(遼寧醫學院沈陽軍區總醫院研究生培養基地，遼寧沈陽110840)

摘要〔〕目的建立一種簡單易行且穩定性、重復性好的大鼠自體動脈血腦出血模型。方法取20只SD大鼠平均分為模型組(10只)和對照組(10只)。大鼠尾動脈置管抽取新鮮動脈血，采用立體定向技術，通過24 G靜脈留置針向大鼠右側尾狀核內注入15、35 μl大鼠自體動脈血。觀測兩組大鼠血腫形態和血腫容積，進行行為學評分。結果兩組大鼠右側尾狀核內均可見血腫形成。模型組大鼠的血腫形成率高，形態規則，占位效應明顯，平均血腫容量為(43.6±6.7)ml，對照組為(34.1±10.3)ml，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組行為學評分與對照組無差異。結論該模型與臨床腦出血相似，操作簡單，重復性好，是腦出血實驗研究和治療干預研究的理想模型。

關鍵詞〔〕腦出血；立體定向

中圖分類號〔〕R743〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：遼寧省科技攻關課題(2011225021)

通訊作者：陶英群(1973-)，男，副主任醫師，副教授，碩士生導師，主要從事功能神經外科及腦出血的微創手術治療研究。

1吉林大學第一醫院

2沈陽軍區總醫院神經外科全軍神經醫學研究所

第一作者：韓偉一(1988-)，男，在讀碩士，主要從事腦出血的基礎與臨床研究。

在腦出血的實驗研究中，建立一種簡單易行且穩定性、重復性好的腦出血模型極為關鍵。大鼠自體動脈血腦出血模型由于操作簡單且與臨床腦出血病理生理相似故被廣泛應用，但仍有許多不足之處。本實驗力求構建一種更為理想而嚴謹的腦出血大鼠模型。

1材料與方法

1.1動物及分組清潔級雄性SD大鼠20只，體重250～350 g，第二軍醫大學藥理學教研室動物實驗中心提供，以標準飼料和飲用純凈水喂養。飼養環境為動物中心多層層流架，恒溫(20℃～25℃)。隨機均分2組，模型組采用二次取血二次注血二次退針法；對照組采用一次取血二次注血一次退針法。

1.2實驗材料數字立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，牙科鉆(307-6型 上海齒科醫械廠)，電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，Mias2000圖像分析系統，50 μl微量注射器(上海高鴿工貿有限公司)，針頭均更換為0.7 mm內徑接頭，可直接與切去接頭的靜脈留置針套管緊密結合；24G靜脈留置針，手術器械一套，10%水合氯醛等。

1.3模型制作

1.3.1立體定向定位大鼠術前8 h禁食，不禁水。稱重后以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔麻醉，俯臥位，備皮后固定大鼠于立體定向儀上，使門齒溝平面比耳間線平面低2.4 mm。局部皮膚消毒、鋪洞巾，從頭部正中皮膚切開約2 cm的縱行切口，30%過氧化氫腐蝕以暴露前囟及冠狀縫，靶點定位于前囟前0.21 mm，右側中線旁開3 mm，顱骨外表面下6 mm。進針點用牙科鉆鉆孔，穿透顱骨至硬腦膜但不傷及腦組織，直徑約1 mm。將靜脈留置針沿鉆孔方向垂直進針6 mm至靶點，用瞬間粘合劑將留置針固定于顱骨，拔除針芯，切除套管針接頭。

1.3.2尾動脈置管鼠尾提前在溫水中浸泡10 min，取尾部上1/3段，刮除角質磷片后消毒鋪巾。沿腹側正中縱行切開皮膚2 cm，在手術顯微鏡下剝離出鼠尾動脈，游離尾動脈約1 cm，動脈夾夾閉遠端，下墊一手術刀柄，待充血后夾閉近端，在管壁上作一切口，在手術顯微鏡下將24G靜脈留置針置于尾動脈中約2 cm，近端斷開動脈夾并結扎固定。

1.3.3自體血注入右側尾狀核用微量進樣器經留置針尾部抽取15 μl動脈血，迅速連接顱部套管針以10 μl/min的速度注入靶點，5 min后以同樣方法取血35 μl并注入靶點，2 min內注完。留針約5 min，先緩慢退針2 mm，停針約3 min后緩慢退出套管針。對照組采用尾動脈穿刺抽血，一次取血50 μl，先注入15 μl(10 μl/min)，停頓2 min，再注入35 μl(2 min)完成造模。取血完成后用乙醇棉球消毒，用紗布包扎鼠尾部傷口，術后用骨蠟封閉顱骨創口，縫合頭皮，局部皮膚用碘酚消毒。

1.4行為學觀察參照Longa〔1〕五級評分法，在大鼠術后24 h進行神經功能缺損評分。1～3分為造模成功。

1.5血腫形態學觀察及血腫容積測定兩組大鼠術后24 h處死，用4%多聚甲醛灌注固定，將腦組織切成冠狀序列切片，層厚1.0 mm。采用Mias2000圖像分析系統，分別測定每個層面血腫最長直徑及面積并計算出血腫容積。

1.6統計學方法用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1神經功能評分模型組大鼠神經功能缺損評分為(2．3±0．82)分，對照組為(1.6±1.17)分，無統計學差異(P>0.05)。

2.2血腫形態觀察模型組所有大鼠尾狀核內均見血腫形成，血腫局限在尾狀核內，呈圓形或橢圓形，形態較規則，占位效應明顯；其中1例標本針道見少量血液反流，但未進入蛛網膜下隙及腦室。對照組8只大鼠有血腫形成，血腫不規則，4例標本針道見少量血液反流，2例破入腦室，無血腫形成。

2.3血腫直徑容量模型組與對照組大鼠血腫最大直徑〔(4.4±0.9)mm、(3.6±0.6)mm〕差異有統計學意義(P<0.05)，血腫容量模型組〔(43.6±6.7)ml〕大于對照組〔(34.1±10.3)ml〕(P<0．05)，均小于注入血液總量。

3討論

大鼠腦出血模型的研究開始于上世紀80年代。目前實驗性腦出血動物模型主要有4種：自體血注入腦出血模型、膠原酶誘導腦出血模型、微球囊充脹壓迫腦出血模型〔2,3〕和自發性腦出血模型〔4〕。1990年Rosenberg等〔5〕建立膠原酶誘導腦出血模型，其最大的缺點是出血過程緩慢，出血多為滲出性，并非實質性的血腫，占位效應不明顯；微球囊腫脹壓迫腦出血模型僅有占位效應，缺點明顯，與臨床腦出血存在較大差異，目前已基本不再使用；自發性腦出血模型與臨床腦出血最接近,但是造價昂貴，出血部位及出血量無法控制，在腦出血實驗研究中的應用受到限制。自體動脈血注入腦尾狀核制作的大鼠腦出血模型，因操作簡單易行，形成的血腫具有良好的穩定性及可重復性而在實踐中應用廣泛，是理想的腦出血模型〔6〕。

目前制作大鼠自體動脈血腦出血模型面臨的主要問題是：①取血：取血部位大致有心臟、頸動脈、股動脈和尾動脈，從股動脈取血創傷較大且嚴重影響后期的行為學評分〔7〕；尾動脈剪尾取血易造成動脈血、靜脈，而采用尾動脈抽血則難度很大，很難保證所需的血量〔8〕。②注血:理論上講，大鼠尾狀核注射50 μl血相當于人腦40 ml的出血量，有學者認為需要注射100 μl血才能保證血腫的穩定性，避免出現針道反流情況〔9〕。為了避免兩次注血過程中血液凝固，有研究者使用了肝素沖管，而使用肝素后會影響血液中凝血酶的作用，凝血酶在腦出血后會釋放毒物，對腦組織造成二次損傷〔8〕。

二次取血二次注血二次退針法模型具有以下優點：①尾動脈置管取血保證了每次注入的血液為新鮮動脈血且不影響后期行為學評分。②避免了使用膠原酶和肝素帶來的外源性物質影響〔10〕。③能夠保證血腫的穩定性，最大限度避免針道反流，兩次注血之間5 min的停頓時間可以有效地防止反流〔11〕。④注血50 μl即能滿足實驗需要。⑤置入尾狀核內的靜脈留置針還可以進一步用于腦出血的藥物干預治療。經過驗證，本模型簡單易行，穩定性和可重復性強，符合臨床腦出血的病理生理過程，是腦出血基礎研究及藥物干預研究的理想模型，有很強的推廣性。

4參考文獻

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5Rosenberg GA,Mun-Bryce S,Wesley M,etal.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Stroke,1990;21(7):801-7.

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9Yang GY,Betz AL,Chenevert TL,etal.Experimental intracerebral hemorrhage:relationship between brain edema,blood flow,and blood-brain barrier permeability in rats〔J〕.J Neurosurg,1994;81(1):93-102.

10Lu Q,Gao L,Huang L,etal.Inhibition of mammalian target of rapamycin improves neurobehavioral deficit and modulates immune response after intracerebral hemorrhage in rat〔J〕.J Neuroinflammation,2014;11:44.

11呂田明,陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動脈血腦出血模型〔J〕.中風與神經疾病雜志,2006;23(1):88-90.

〔2015-03-17修回〕

(編輯郭菁)