骨髓間充質干細胞治療腦梗死的研究進展

骨髓間充質干細胞治療腦梗死的研究進展

王萬松屈新輝1吳曉牧1

(南昌大學醫學院,江西南昌330006)

關鍵詞〔〕骨髓間充質干細胞；移植；腦梗死；缺血再灌注

中圖分類號〔〕R743.3〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助課題(No.81160148)

通訊作者：屈新輝(1970-)，男，主任醫師，碩士生導師，主要從事帕金森病及干細胞的基礎和臨床研究。

1江西省人民醫院神經內科 江西省神經病學研究所

第一作者：王萬松(1988-)，男，碩士，主要從事干細胞的基礎研究。

腦梗死是常見的腦血管病類型，因腦血管供血障礙而引發缺血性級聯反應，造成神經功能缺損。隨著人口老齡化，其發病率逐年上升，成為人類死亡和殘疾的主要病因之一。目前，針對腦梗死的溶栓治療因嚴格的時間窗而限制了獲益患者。傳統藥物治療雖然使疾病死亡率有所下降，但多數患者仍殘存神經功能缺損，嚴重影響患者生活質量。自干細胞移植理論的興起，骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植治療腦梗死的研究中發現移植BMSCs可促進腦梗死后功能改善〔1〕和組織修復〔2〕，并有望成為臨床腦梗死治療的新方法。

1BMSCs的特性

BMSCs是具有自我更新和多向分化能力的中胚層源成體干細胞，最早由Friedenstein等〔3〕從骨髓分離培養，體外形如長梭紡錘狀，貼壁集落生長；固定高表達CD90、CD106、CD29等，低表達或不表達CD34、CD45、CD11b等，區別于造血干細胞，被認為是骨髓中的非造血成分，參與造血微環境的構成。一般情況下可分化為脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞等中胚層源細胞，而其分化方向和免疫表型受外界微環境因素影響，在誘導因素作用下，可跨胚層分化為神經細胞等〔4〕，并且研究發現腦組織提取液可促進BMSCs分化為神經元和神經膠質細胞〔5〕。

BMSCs具有調節免疫炎癥作用，通過影響抗感染和炎癥因子的分泌，降低炎癥對組織的損傷〔6〕，同時可抑制炎癥環境中神經膠質細胞活化〔7〕，具有免疫調節作用。Zimmermann等〔8〕發現BMSCs可通過自身的旁分泌作用調節炎癥信號通路，或許BMSCs可通過多重機制調節免疫炎癥。另有研究發現BSMCs在缺氧環境中上調缺氧誘導因子(HIF)的表達，并通過加強營養因子和生長因子的分泌起到抗凋亡作用〔9〕。通過免疫炎癥的調節及營養和生長因子的分泌，BMSCs具有重塑其所在微環境的功能。BMSCs可自體提供、取材安全、無道德倫理沖突，再者，容易培養、擴增周期短、異體移植未見排異〔10〕，因此，相對其他類型干細胞而言，BMSCs應用更為廣泛。

2BMSCs移植治療腦梗死研究

幾乎在所有的動物實驗中，移植BMSCs均能有效改善神經功能缺損癥狀。Suzuki等〔11〕選擇腦梗死后6 h移植BMSCs，發現隨著梗死體積明顯減小，神經功能缺損得到顯著改善。而Ding等〔12〕在腦梗死后第5天移植BMSCs，雖然也觀察到神經功能缺損癥狀的好轉，但卻未發現梗死體積縮小?？梢姽Ｋ荔w積并不是功能預后的決定因素，并且能否有效減少梗死體積與移植時間點密切相關。Gutierrez-Fernandez等〔13〕移植BMSCs后雖然也發現梗死體積沒有差異，但在改善神經功能缺損的同時，凋亡細胞數目減少，細胞增殖明顯，并認為BMSCs可保護腦梗死后受損的細胞免于凋亡，從而修復受損組織，提高神經功能。在關于腦梗死后移植BMSCs減少細胞凋亡的實驗中，Deng等〔14〕選擇在腦梗死后24 h靜脈移植BMSCs，并且在移植后14 d和28 d發現血管內皮生長因子(VEGF)水平的升高和細胞凋亡的減少密切相關，并認為腦梗死缺血半暗帶的血液供應對于抗凋亡至關重要。Bao等〔15〕則證實BMSCs通過旁分泌作用，分泌大量腦源性神經營養因子(BDNF)，營養支持受損神經細胞，有效阻止凋亡，并促進神經發生。Li等〔16〕發現移植BMSCs后，腦梗死病灶周圍抗炎因子白細胞介素-10(IL-10)的表達上升，降低炎癥對神經細胞的持續損害，減少細胞凋亡，并且室管膜下區細胞增殖明顯。如上所述，BMSCs可通過增強血液供應、營養支持和調節炎癥起到抗凋亡作用，達到組織修復效果。Zhang等〔17〕證實BMSCs可以激活具有促進細胞增殖功能的sonic hedgehog信號通路，促進腦梗死后少突膠質細胞增殖，修復受損神經軸突。

但是BMSCs對腦梗死的治療效果仍然受限于BMSCs存活時間短暫的問題。Goldmacher等〔18〕發現移植后腦梗死病灶中的BMSCs在第8天全部消失。為此，為獲得更大療效或發揮BMSCs的治療潛能，延長干細胞的存活時間成為突破當前瓶頸的新思路。

3BMSCs治療腦梗死的新策略

3.1缺氧預處理BMSCs腦梗死缺血缺氧導致的炎癥反應、氧化應激反應和大量凋亡因子等都不利于移植后BMSCs的存活。但Liu等〔19〕發現BMSCs在含氧量僅為3%的缺氧環境中，激活具有調節細胞增殖、分化和凋亡功能的PI3K/Akt信號通路，上調HIF的表達，提高BMSCs對缺氧環境的耐受，延長BMSCs的存活時間。眾多學者重點研究了移植缺氧預處理的BMSCs治療腦梗死。Wei等〔20〕發現缺氧預處理后的BMSCs歸巢明顯，可定植于梗死皮層，并且有效減少梗死體積和缺血半暗帶處死亡細胞數。另一研究〔21〕發現將缺氧預處理后的BMSCs移植入腦梗死模型中有著強烈的神經發生和血管再生，并認為缺氧預處理能有效提高BMSCs的治療潛能。

3.2基因修飾BMSCs鑒于BMSCs可旁分泌BDNF、VEGF等蛋白促進腦梗死的修復，利用內源性基因轉染BMSCs后移植，則可使相關蛋白基因高表達，將有助于病灶修復。van Velthoven等〔22〕將BDNF基因修飾BMSCs后移植，發現BDNF強烈分泌并有效改善神經功能缺損，但是在移植后第28天與單純移植BMSCs組神經功能缺損無差異，治療效果主要受限于基因修飾后BMSCs不能長時間穩定高表達目的蛋白。Liu等〔23〕將一種名為Survivin的抗凋亡基因轉染BMSCs后移植，發現在提高BMSCs存活率和延長其存活時間的同時，BMSCs長時間旁分泌VEGF和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。Shen等〔24〕將一種名為依達拉奉(MCI-186)的氧自由基清除劑基因轉染BMSCs后移植，發現BMSCs存活率的提高使BDNF和VEGF得到高表達。

除了單基因轉染，有學者成功將多重基因轉染BMSCs，并將其移植治療腦梗死。Ding等〔12〕將具有促神經發生功能的Noggin基因和神經生長因子(NGF)基因雙基因轉染BMSCs后移植，兩種內源性蛋白協同高表達，較單基因轉染移植，BMSCs分化為神經細胞現象更為明顯。雖然干細胞結合基因治療腦梗死更具療效，但是出于安全性的考慮，其尚未應用于臨床。

3.3誘導BMSCs為神經樣細胞BMSCs可多向分化，并能分化為神經細胞；但研究發現在腦梗死病灶BMSCs僅少量表達nestin，未能分化為成熟的神經細胞〔25〕。將BMSCs誘導為神經細胞后移植成為一新思路。Heo等〔26〕將BMSCs誘導成為神經元樣細胞，移植后抗炎效果加強，但是神經元樣細胞在梗死灶邊緣并未分化為成熟的神經細胞。顯然誘導BMSCs為神經細胞后移植仍不成熟。首先，對于誘導BMSCs為神經細胞的有效性存在爭議，Thomas等〔27〕發現誘導的BMSCs僅具有神經細胞形態而不具備相應功能。其次應考慮誘導劑的毒副作用，尤其是化學誘導劑具有的細胞毒性作用，將會影響細胞骨架的穩定和變形能力。

4移植BMSCs的途徑和數量

目前關于BMSCs的移植途徑主要為靜脈途徑、頸動脈途徑和立體定向途徑。(1)靜脈途徑：其最大優點在于創傷微小，風險較低，可操作性強。缺點在于BMSCs歸巢量微少，大部分細胞都滯留于肺脾等外周器官〔28〕，而且細胞容易相互凝集形成細胞栓子，造成外周器官栓塞，尤其以肺栓塞多見。(2)頸動脈途徑：優點在于可以避免外周器官阻滯BMSCs，同時可以最小創傷向病灶移植大量BMSCs。缺點在于容易造成腦動脈栓塞形成，引發腦梗死。(3)立體定向途徑：其優點在于直接向病灶移植BMSCs，提高細胞利用率，增強療效。Kawabori等〔29〕證實立體定向途徑移植1 106的細胞量，其療效優于靜脈途徑移植3 106的細胞量。其缺點在于損害腦組織、創傷較大，引發顱內高壓，操作難度大。

關于移植細胞數量，目前主要集中在1×104～107等范圍〔13，30〕，Wang等〔30〕證實移植1×106～107的細胞量療效優于1×104～105的細胞量。但是這并不意味移植的細胞數量越多，療效越好。首先，血液途徑移植，細胞濃度越高越容易形成細胞栓塞。其次，梗死灶貧瘠的微環境不足以營養支持大量的干細胞，造成干細胞的存活率降低，結果可能適得其反。

5BMSCs治療腦梗死的具體機制

BMSCs治療腦梗死有其獨特的優點：(1)都能有效改善神經功能缺損癥狀。(2)相對其他治療措施，極大延長了治療時間窗〔31〕。(3)是基因工程治療的良好載體。(4)未見腫瘤等不良事件發生。

但是目前對于BMSCs治療腦梗死的具體機制不明，可能與以下幾個方面有關。(1)細胞替代：BMSCs移植治療腦梗死最初目的在于替代壞死細胞以恢復受損結構。然而其有效性飽受爭議。首先，血管途徑移植BMSCs的歸巢量微少〔28〕及在腦梗死慢性期膠質瘢痕的限制阻礙，能有效定植壞死部位的干細胞數量微少。再者，移植后雖然有小部分BMSCs表達神經元和膠質細胞表面標志物，但是其是否具有相應功能有待進一步確定。(2)營養支持：研究表明移植BMSCs后凋亡的細胞數顯著減少并改善神經缺損，這可能與BMSCs的營養支持相關。研究表明移植后BMSCs可分泌BDNF、GDNF、bFGF等多種營養因子〔15，23〕，對受損的神經細胞提供營養支持。(3)免疫炎癥調節：BMSCs能旁分泌TGF-β(轉化生長因子)抑制免疫細胞的播散，有效減少炎癥細胞的浸潤〔32〕，可調節外周血中的調節性T細胞活性，減少炎癥細胞對梗死灶損害〔30〕。(4)血管再生：BMSCs可分泌VEGF支持血管再生，并且研究表明移植BMSCs后缺血半暗帶血管發生明顯〔14〕。(5)促進內源性修復：Li等〔33〕研究證實腦梗死后大腦自身啟動自我修復，包括祖細胞的生成、神經發生和血管新生。而BMSCs可支持祖細胞的生成、促進神經發生和加強血管新生以促進修復。

在腦梗死后不同時期移植BMSCs，其具體治療機制可能有所偏重。研究證實腦梗死早期移植BMSCs主要通過炎癥抑制和營養支持發揮療效〔34〕，而恢復期移植BMSCs則偏重于血管再生〔31〕和抑制膠質瘢痕形成以恢復功能。

6展望

目前已從多角度多方向研究利用BMSCs移植治療腦梗死，并且臨床試驗業已開展，但是仍然有著許多問題亟需解決和值得深入研究。這包括預處理干細胞的最佳方式、影響干細胞存活的決定因素、移植模式以及干細胞在體內的蹤跡和最終結局，這些問題的盡早解決關系到治療效果的穩定性和安全性，有利于進一步開展臨床試驗。

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〔2014-11-22修回〕

(編輯袁左鳴)