RNAI-基因敲除技術(shù)及其在腫瘤研究中的進(jìn)展

RNAI-基因敲除技術(shù)及其在腫瘤研究中的進(jìn)展

王佳

(天津市天津醫(yī)院，天津300211)

關(guān)鍵詞〔〕基因敲除； RNAI-基因敲除技術(shù)；腫瘤

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：王佳(1973-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科研究。

基因敲除技術(shù)又被稱(chēng)為基因編輯技術(shù)，是采取不同方式對(duì)原有的基因予以切斷，然后安插新基因的技術(shù)。RNAI-基因敲除技術(shù)是一種重要的基因敲除技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于對(duì)各種疾病治療的研究之中。其中，在腫瘤治療相關(guān)研究中的應(yīng)用十分突出。受到自身高度特異性和高效性的影響，從細(xì)胞水平角度進(jìn)行分析，RNAI成為一種十分理想的基因敲除工具〔1〕。后基因組時(shí)代，在進(jìn)行各種功能基因組學(xué)研究的過(guò)程中，RNAI逐漸引起人們的廣泛關(guān)注，并成為一種十分重要的研究手段。目前RNAI在多種病毒感染性疾病以及腫瘤治療的研究中都得到了大量的應(yīng)用，并取得一定的理論和實(shí)踐成果。筆者即對(duì)RNAI-基因敲除技術(shù)及其在腫瘤研究中的進(jìn)展情況作一綜述。

1RNAI-基因敲除技術(shù)概述

1.1RNAI-基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù)是通過(guò)一定的基因工程途徑，對(duì)機(jī)體內(nèi)特定的基因予以不同的處理使其發(fā)生缺失或者失活的技術(shù)〔2〕。多種條件會(huì)引起基因敲除，包括基因突變和同源重組以及RNAI等。其中，RNAI-基因敲除技術(shù)是一種重要的類(lèi)型。RNA表示核糖核酸，是一種特殊的“化學(xué)信使”，在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮著十分重要的作用。借助RNAI可以關(guān)閉特定基因的表達(dá)，RNAI-基因敲除技術(shù)又被稱(chēng)為核糖核酸干擾，是單分子RNA分裂時(shí)出現(xiàn)的某種蛋白質(zhì)合成受到抑制的現(xiàn)象。RNAI基因敲除技術(shù)是一種mRNA水平上的基因沉默機(jī)制，具有高度的特異性。RNAI由內(nèi)源性或外源性dsRNA誘發(fā)，在細(xì)胞內(nèi)，一定的條件下，dsRNA會(huì)被切割成21～25 nt具有較小干擾性的RNA，即siRNA。siRNA可以通過(guò)介導(dǎo)識(shí)別方式，對(duì)同源性靶mRNA分子進(jìn)行一定的靶向切割，從而對(duì)該基因功能產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致其出現(xiàn)無(wú)法表達(dá)的情況。1994年，有學(xué)者通過(guò)對(duì)華麗新小桿線蟲(chóng)早期胚胎的分析研究，發(fā)現(xiàn)在其RNA的發(fā)育過(guò)程中，在分配體細(xì)胞和生殖腺細(xì)胞的時(shí)候，胚胎早期大部分RNA轉(zhuǎn)錄本會(huì)在較短的時(shí)間內(nèi)即發(fā)生降解。但是，如果在胚胎中導(dǎo)入具有阻抑效應(yīng)的外源性RNA，便可以產(chǎn)生較強(qiáng)的阻抑效應(yīng)，并持續(xù)到下一代。1995年，有學(xué)者在對(duì)華麗新小桿線蟲(chóng)par1基因相關(guān)功能進(jìn)行研究的時(shí)候，在新小桿線蟲(chóng)中導(dǎo)入par1基因的反義RNA，獲得par1基因缺陷引起的par1擬表型。并通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在導(dǎo)入par1基因之后，在相應(yīng)的意義鏈上，也會(huì)產(chǎn)生par1擬表型，這一par1擬表型與導(dǎo)入par1基因的反義RNA是相同的。研究結(jié)果表明，反義RNA以及有意義RNA均可以發(fā)揮出相似的阻抑效應(yīng)。還有學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了進(jìn)一步的深入研究，并通過(guò)研究提出，在通過(guò)一定的途徑和方式被攝入機(jī)體細(xì)胞中之后，雙鏈RNA可以對(duì)其同源基因(靶基因)的表達(dá)產(chǎn)生很強(qiáng)的特異性抑制作用。最終，學(xué)者還將這一雙鏈RNA命名為 “RNAI”〔3～5〕。

1.2RNAI-基因敲除技術(shù)的機(jī)制和特點(diǎn)RNAI-基因敲除技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中，會(huì)利用一定的基因工程途徑，對(duì)機(jī)體內(nèi)特定的基因予以不同的處理。通過(guò)一定的處理，會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的基因缺失或者失活現(xiàn)象。在RNAI的效應(yīng)階段，siRNA雙鏈會(huì)與一個(gè)核酶復(fù)合物發(fā)生結(jié)合，并構(gòu)成一個(gè)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)。在對(duì)RISC進(jìn)行激活的時(shí)候，需要通過(guò)一定的過(guò)程。在距離siRNA3'端一定的位置，需要切割相應(yīng)的mRNA。但是關(guān)于切割的確切機(jī)制，目前尚缺乏十分清楚的結(jié)論。但是，在每個(gè)沉默復(fù)合物中，都包含一個(gè)不同于Dicer的RNA酶以及一個(gè)siRNA。在臨床治療應(yīng)用過(guò)程中，主要是通過(guò)清除細(xì)胞病毒途徑和“關(guān)閉”病原體特定基因途徑。清除病毒途徑是應(yīng)用分子中獨(dú)有的生物活性分子，同時(shí)致使病原體基因mRNA形成含藥靶點(diǎn)標(biāo)記；永久“關(guān)閉”病原體特定基因途徑，是臨床提取患者自體病基因mRNA含藥靶點(diǎn)標(biāo)記，通過(guò)體外RNAI生物轉(zhuǎn)錄合成的專(zhuān)項(xiàng)抗體因子來(lái)阻斷病原體生物復(fù)制鏈、致使病原體相應(yīng)蛋白質(zhì)無(wú)法合成，繼而達(dá)到永久“關(guān)閉”病原體特定基因的作用。這條途徑治療過(guò)程中只是“關(guān)閉”病原體特定基因，而對(duì)正?；虮旧頍o(wú)損害。RNAI-基因敲除技術(shù)具有十分明顯的特點(diǎn)。首先，該技術(shù)具有易操作性?，F(xiàn)如今，很多生物技術(shù)公司已經(jīng)研制并生產(chǎn)出有效的RNAi 載體，從而為各種疾病的治療提供了更多有利條件。其次，在對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行抑制的過(guò)程中，RNAI-基因敲除技術(shù)具有十分明顯的高效性。另外，RNAI-基因敲除技術(shù)還具有十分明顯的序列特異性〔6〕。

2RNAI-基因敲除技術(shù)在腫瘤相關(guān)研究中的應(yīng)用

RNAI-基因敲除技術(shù)的應(yīng)用范圍十分廣泛，可以被積極地應(yīng)用于各種腫瘤相關(guān)研究之中。

2.1RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制癌基因表達(dá)每個(gè)人體內(nèi)都有原癌基因，絕對(duì)不是每個(gè)人體內(nèi)都有癌細(xì)胞。原癌基因主管細(xì)胞分裂、增殖，而且人體里還有抑癌基因。平時(shí)，原癌基因和抑癌基因維持著平衡，但在致癌因素作用下，原癌基因的力量會(huì)變大，而抑癌基因卻變得較弱。因此，致癌因素是啟動(dòng)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的“鑰匙”，主要包括精神因素、遺傳因素、生活方式、某些化學(xué)物質(zhì)等。多把“鑰匙”一起用，才能啟動(dòng)“癌癥程序”；“鑰匙”越多，啟動(dòng)機(jī)會(huì)越大。腫瘤可以為良性和惡性。原癌基因的活化包括多種情況，例如染色體重排和插入突變、點(diǎn)突變、基因擴(kuò)增。對(duì)于上述不同類(lèi)型的活化癌基因mRNA而言，均可以通過(guò)RNAI技術(shù)對(duì)其產(chǎn)生有效抑制，從而達(dá)到對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有效抑制的目的。

2.1.1RNAI-基因敲除技術(shù)用于敲除點(diǎn)突變激活的癌基因在敲除點(diǎn)突變激活癌基因，可達(dá)到理想腫瘤治療效果的過(guò)程中，RNAI技術(shù)是一個(gè)十分理想的工具。k-ras是一種原癌基因，當(dāng)k-ras基因突變時(shí)，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變。對(duì)于發(fā)生突變的ras基因而言，與正常細(xì)胞中存在的野生型ras基因進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，二者之間存在較大的相似性，僅有一個(gè)堿基不同〔7〕。但是，RNAI具有高度的特異性，因此可以專(zhuān)門(mén)針對(duì)腫瘤細(xì)胞中發(fā)生突變的ras基因發(fā)揮作用，產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制效果。而對(duì)于正常細(xì)胞中存在的野生型ras基因，則不會(huì)產(chǎn)生抑制。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體shRNA表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以在體外環(huán)境下對(duì)Capan-1胰腺癌細(xì)胞內(nèi)k-ras基因的表達(dá)產(chǎn)生特異性的抑制。另外，也可以對(duì)裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生較為明顯的抑制作用。

2.1.2RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制基因擴(kuò)增在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，原癌基因會(huì)發(fā)生基因擴(kuò)增現(xiàn)象。在基因擴(kuò)增過(guò)程中，原癌基因可以在原來(lái)染色體上，利用一定的機(jī)制，通過(guò)復(fù)制達(dá)到多個(gè)拷貝數(shù)〔8〕。于是，通過(guò)擴(kuò)增，相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)出現(xiàn)異常增多的情況，細(xì)胞大量增殖。在多種上皮性腫瘤中，表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR(ErbB1)都會(huì)出現(xiàn)基因擴(kuò)增的情況，并對(duì)腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生極大的影響〔9〕。以往還有研究發(fā)現(xiàn)，采用化學(xué)合成方式可以獲得實(shí)驗(yàn)所需的anti-erbB1 siRNA，并對(duì)A431細(xì)胞內(nèi)erbB1的表達(dá)予以有效抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增加，并削弱腫瘤的增殖。

2.1.3RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制融合基因表達(dá)在各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，染色體重排指的是癌基因從原本所在染色體位置上發(fā)生轉(zhuǎn)移，到達(dá)另一個(gè)染色體某一位置上的過(guò)程中〔10〕。這一過(guò)程會(huì)對(duì)相應(yīng)的調(diào)控作用產(chǎn)生影響，導(dǎo)致其被激活。于是，大量異常基因產(chǎn)物出現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)惡性增殖。在人9號(hào)染色體上存在C-ABL基因，22號(hào)染色體上存在BCR基因，在一定的條件下，兩種基因發(fā)生易位，并會(huì)導(dǎo)致無(wú)關(guān)基因出現(xiàn)融合，最終形成BCR/ABL融合基因〔11〕。BCR/ABL融合基因是慢性髓性白血病(CML)致病的始動(dòng)和核心因素，并與疾病的發(fā)生存在十分密切的聯(lián)系〔12〕。而利用RNAI-基因敲除技術(shù)，則可以對(duì)相應(yīng)的融合基因mRNA表達(dá)予以有效抑制，達(dá)到控制疾病的目的。

2.2RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制其他與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)在各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，除了與癌基因被激活有關(guān)之外，還會(huì)出現(xiàn)多種形式基因的改變。具體來(lái)看，腫瘤的發(fā)病機(jī)制會(huì)受到諸多因素的調(diào)控，其中，細(xì)胞凋亡障礙是一個(gè)重要的機(jī)制〔13〕。在細(xì)胞凋亡方面，涉及到諸多類(lèi)型的基因，包括Bcl-2基因和raf-1基因等。而RNAI-基因敲除技術(shù)在對(duì)各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程進(jìn)行抑制過(guò)程中，其作用的發(fā)揮便與各種凋亡基因之間存在一定的關(guān)系。Bcl-2基因是Bcl家族中重要的抗細(xì)胞凋亡基因，它能夠抑制細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后之間存在十分密切的聯(lián)系〔14〕。Bcl-2則可抑制細(xì)胞凋亡，其異常表達(dá)也與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是人體的自然過(guò)程，該過(guò)程可迫使受損細(xì)胞死亡，而B(niǎo)cl-2基因卻幫助癌細(xì)胞繼續(xù)存活〔15〕。raf-1基因也是一種抗凋亡基因，并和白血病的發(fā)生以及臨床耐藥之間具有十分緊密的聯(lián)系。因此，臨床對(duì)腫瘤進(jìn)行治療的過(guò)程中，可以通過(guò)對(duì)Bcl-2和raf-1mRNA表達(dá)的抑制，達(dá)到對(duì)白血病細(xì)胞等的增殖予以有效抑制的目的〔16〕。在腫瘤治療過(guò)程中，對(duì)腫瘤血管生成予以有效抑制是一個(gè)十分重要的策略，而利用RNAi-基因敲除技術(shù)，通過(guò)anti-VEGF siRNA可以對(duì)抑制相關(guān)因子的表達(dá)，以抑制腫瘤生長(zhǎng)〔17〕。另外，各種腫瘤的臨床治療過(guò)程中，耐藥是一個(gè)十分突出的問(wèn)題。耐藥性的存在會(huì)對(duì)多種類(lèi)型腫瘤的臨床治療產(chǎn)生不利影響，并與多藥耐藥基因的表達(dá)之間存在一定的關(guān)系。為此，通過(guò)anti-MDR siRNA，便可以達(dá)到很好的抑制細(xì)胞耐藥的效果，提高臨床治療水平。

3RNAI-基因敲除技術(shù)應(yīng)用于腫瘤研究中的問(wèn)題

RNAI-基因敲除技術(shù)應(yīng)用于腫瘤研究中的過(guò)程中，雖然獲得了一定的研究成果，但也仍然存在一定的問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，RNAI-基因敲除技術(shù)的毒理作用一直是一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容〔18〕。在機(jī)體中，干擾素是一種十分重要的物質(zhì)，可以對(duì)機(jī)體內(nèi)多種不同的代謝途徑予以有效激活，并對(duì)RNaseL降解mRNA產(chǎn)生一定的誘導(dǎo)作用，從而對(duì)機(jī)體內(nèi)正常的細(xì)胞代謝過(guò)程產(chǎn)生影響〔19，20〕。而RNAI技術(shù)則會(huì)對(duì)干擾素的出現(xiàn)產(chǎn)生一定的影響，從而對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生一定的不利影響。另外，關(guān)于RNAI在體內(nèi)的具體作用方式相關(guān)細(xì)節(jié)問(wèn)題，目前仍然缺乏十分系統(tǒng)、明確的闡釋。還有研究指出，HBV病毒的RNAI會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性作，導(dǎo)致大面積正常細(xì)胞出現(xiàn)死亡。但關(guān)于其具體的作用機(jī)制，至今尚不甚清楚。另外，在RNAI抗性方面，也存在一定的問(wèn)題。如果通過(guò)自身形成另一種較為特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)或者RNA結(jié)合特異性的蛋白的方式來(lái)對(duì)RNAI結(jié)合位點(diǎn)予以封閉，會(huì)導(dǎo)致RNAi作用的下降。另外，在RNAI治療方面，也面臨一定的問(wèn)題。在獲取siRNA的過(guò)程中，存在一定的難度〔21〕。而如果采用化學(xué)方式進(jìn)行合成，又會(huì)對(duì)其自身穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響〔22〕。而且，在具體的治療過(guò)程中，如何進(jìn)行導(dǎo)入也是一個(gè)十分棘手的問(wèn)題。如果采用常規(guī)肌肉注射或者靜脈注射的方式，在體內(nèi)siRNA的存在時(shí)間很短，無(wú)法有效發(fā)揮持久的作用，臨床效果不甚理想。

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〔2015-07-01修回〕

(編輯曲莉)