載脂蛋白E基因型在老年人群中的分布及與老年認知損傷的關系

殷淑琴 聶宏偉 徐 勇(湖州師范學院，浙江 湖州 33000)

老年癡呆已經成為危及老年健康和社會經濟發展的重大公共衛生問題。認知功能損傷作為發展為老年癡呆的過渡階段得到了人們的關注，研究影響認知功能損傷發生的相關因素也成為國內外研究的熱點問題〔1～4〕。本次研究針對國內外研究存在很大爭議的基因進行分析，旨在為早期預防高危人群提供理論依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 在蘇州和湖州市農村的5個社區，選取546例老年人作為研究對象，男247例，女 299例，平均年齡(67.25±9.87)歲。由經過系統培訓的3名神經內科醫師采用蒙特利爾認知功能量表(MOCA)〔5〕對老年人進行認知能力測評。量表評估項目主要包括注意與集中、執行功能、記憶、語言、視結構技能、抽象思維、計算和定向力等8個領域，量表總分30分，其中≥26分為正常，＜26分為輕度認知功能損害〔6〕。

1.2載脂蛋白(Apo)E基因型檢測方法〔7〕取血細胞，溶入生理鹽水2 ml，采用DNA提取試劑盒，按說明提取DNA，應用瓊脂糖凝膠電泳技術檢測DNA純度，再用Eppendorf核酸定量儀測定 DNA 濃度(260 nm 吸光率＞0.05，DNA 含量＞2.0 μg/μl，吸光率A260/A280比值為1.6～1.8，320 nm波長處吸光率接近0)。PCR擴增:根據美國國家生物技術信息中心(NCBI)相關文獻提供的研究結果，確定候選目的基因片段，利用GenBank上提供的序列設計引物，由上海生工合成。PCR反應體系(總體系20 μl)采用10×PCR Buffer(含15 mmol/L MgCl2)2 μl，Hot-Star Taq DNA Polymerase(QIAGEN 公司)0.2 μl，5×Q-Solution 4 μl，dNTPmix(每 種 10 mmol/L)2 μl，Primer1 1 μl，Primer2 1 μl，模板 DNA 1 μl，蒸餾水 8.8 μl。將測序樣本置 ABI-2700型擴增儀中95℃ 預變性15 min，用Touchdown-PCR，94℃變性50 s，63℃ ～58℃退火 1 min(－0.5℃ /1 min)，72℃延伸 1 min，共循環10次，94℃變性50 s，57℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共循環30次，最后于72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產物是否為單一目的條帶，根據V-GENE公司提供的PCR純化試劑盒，對PCR產物過柱純化后，進行測序反應:反應體系 1 μl BigDye(2.5 倍)+1.5 μl BigDye Seq Buffer(5 倍)+3 μl引物+1 μl PCR 純化產物+3.5 μl雙蒸水。測序熱循環條件:96℃，10 s→(96℃10 s→50℃5 s→60℃4 min)×25個循環→60℃，4 min→4℃保溫。測序反應后純化:每管加入125 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)1 μl到管底，再加入3 mol/L醋酸鈉(NaAc)1 μl→每管加入 100% 酒精 25 μl，鋁箔封嚴密，震蕩混勻4次，室溫放置15 min→1 600 r/min，離心45 min，馬上倒置于96孔ABI板，離心至185 r/min，停止離心→每管加入 75% 酒精35 μl，1 650 r/min，4℃ 離心 15 min(JOUANBR4i);立即倒入96孔板，離心至185 r/min停止離心→重復第4步驟1次→室溫揮發凈酒精，加入10 μl Hi-DiFormamide溶解DNA→樣品在95℃變性4 min，迅速置冰中冷卻4 min。基因測序:電泳前，在數據采集(DataCollection 2.0)軟件中選擇正確的運行模塊和分析模塊。上樣至3100-Avant遺傳分析儀進行電泳。應用Data Collection軟件自動進行數據處理和分析。結果分析:將測序結果用DNA Sequencing Analysis 5.1自動分析原始測序數據，獲得測序電泳圖和序列。將樣品序列用DNA Star Seqman與標準序列進行比對，觀察樣本基因序列的多態性。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件行χ2檢驗。

2結果

2.1老年人群ApoE基因型分布情況分析 ApoE基因型分布中E3/3純合子頻率最高，占 72.89%，E2/2型最少，僅占1.28%，其余E3/4型占11.90%、E2/3型占8.61%、E4/4型占3.3%、E2/4占2.01%。

2.2老年認知損傷與ApoE基因型的關系 根據MoCA檢測結果，546例老年人中有189例老年人為認知損害。以189例老年認知損害作為病例組，以其余357例為對照組，比較兩組ApoE基因型頻數分布情況，結果表明，認知損傷的老人中攜帶ApoE E4等位基因率明顯高于對照組〔32.3%(61/189)vs 9.2%(33/357)，χ2=46.658，P＜0.001〕，病例組 E2(3/189)、E3(125/189)與對照組E2(4/357)、E3(320/357)比例無顯著差異(P＞0.05)。

3討論

認知功能損傷人群癡呆的轉化率為正常人群的10倍，給社會和家庭帶來的沉重的負擔〔8〕。預防及控制老年癡呆的發生成為臨床醫生和公共衛生專家關注的重點。針對可能預防的因素進行重點預防，對認知功能損害的高危人群進行重點干預是改善老年人健康的重要策略。國內外研究認為影響認知功能損傷的因素很多，包括生活習慣等因素:高血壓、高脂血癥、糖尿病、冠心病、吸煙、飲酒、抑郁等〔9～11〕，還包括體質指標:淀粉樣前體蛋白(APP)、氧化因子、炎癥因子、神經生長因子(NGF)、氨基酸、tau蛋白和Aβ等，ApoE作為一個高危因素引起了研究人員的重視。

人群ApoE基因具有明顯的遺傳多態性，共有6種表型，是根據三種等位基因不同組合后產生的3種純合子E2/2、E3/3、E4/4和3種雜合子E3/2、E4/3、E4/2。當前研究認為ApoE基因與認知功能的損傷存在很大的相關性，Borenstein等〔12〕研究認為，E3/3等位基因的存在是認知功能損害的危險因素，與Niti等〔13〕研究結論一致;Unverzagt等〔14〕對非洲人種的基因狀況進行研究，結果表明不存在種族的差異性;Erdan〔15〕、呂小榮等〔16〕學者對中國人群進行研究，均認為E3/3是高危基因，但對E2/2基因是否是低危因素還存在爭議。本次研究結論認為ApoE等位基因對認知功能的損傷具有明顯的影響，與國內外學者的研究結論一致，但對E2/2基因攜帶者是否是先天性的低危人群還有待研究。本次研究雖然證明了ApoE基因對老年人認知功能的影響，但還存在一定的局限性:(1)樣本量較小，樣本人群具有地域局限性;(2)未能評估Apo E基因對老年人認知功能的相對危險度，僅僅是定性研究。因此本次研究的結論還需要長期的大規模隨訪研究來證實。

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