中藥有效成分保護腦缺血再灌注損傷的研究進展

吳錦萍 張春兵 (南京中醫藥大學基礎醫學院，江蘇 南京 20023)

腦缺血再灌注損傷(CIRI)的機制主要是興奮性氨基酸神經毒性、神經元超微結構的變化、氧化應激、炎癥反應、鈣離子超載等〔1，2〕。中藥有效成分可從多個方面發揮保護腦缺血再灌注損傷的作用，其作用機制值得進一步研究。

1 抑制興奮性氨基酸引起的神經毒作用

興奮性氨基酸(EAA)主要包括谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)。腦缺血再灌注損傷主要與Glu的大量釋放和N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體激活有關。腦缺血后，缺血神經元持續去極化，細胞膜上谷氨酸轉運體失表達，反向轉運大量Glu，導致細胞間隙Glu濃度升高，引起神經細胞水腫。同時突觸外NMDA受體被激活，突觸后膜Ca2+、Na+跨膜轉運通道開放，引起胞內Ca2+超載，導致神經元的遲發性死亡。然而，也有研究表明突觸NMDA受體對腦缺血組織起保護作用，突觸NMDA受體激活后，誘導產生信號調節轉錄因子和腦源性神經營養因子，對抗神經興奮毒作用和抑制凋亡基因表達〔3〕。由此，可見腦缺血后谷氨酸受體具有雙向作用。

中藥有效成分可通過抑制EAA的釋放或者下調NMDA受體，保護CIRI。石少明等〔4〕研究發現丹酚酸可顯著減少缺血區腦組織的Glu和γ-氨基丁酸(γ-GABA)的含量，減少腦缺血后神經元損傷。沈慧等〔5〕認為茶氨酸可以有效調節CIRI后氨基酸類神經遞質的釋放，競爭結合谷氨酸受體，抑制谷氨酸循環，減少谷氨酸在突觸間隙的集聚等途徑來減緩CIRI。

2 改善腦卒中后神經血管單元功能和保護神經元超微結構

近年來，腦缺血后神經血管單元(NVU)再生成為人們研究的熱點。NVU是由微血管、星形膠質細胞、神經元、神經元足突以及一些支持細胞如微膠質細胞和少突細胞等組成。神經元作為NVU中一個重要組成部分，其超微結構的改變對神經血管單元的功能有著重要的影響。缺血半暗區神經元的超微結構的損傷主要是細胞膜、核膜、線粒體、核染色質以及內質網和核糖體等結構破壞，并且各自功能發生障礙。腦缺血后，微血管、星形膠質細胞核、神經元相互作用，引起神經元或細胞外基質炎癥因子、炎癥介質的釋放，導致神經元的損傷。鄭小影等〔6〕探討黃芩葉總黃酮(SSTF)預處理對缺血再灌注大鼠腦細胞超微結構損傷的保護作用，結果顯示模型組大鼠腦皮質線粒體結構遭到破壞，線粒體功能損傷，而SSTF預處理大鼠線粒體和血管內皮損傷明顯減輕。馬立等〔7〕從保護神經元和神經血管兩方面概述三七總皂苷對CIRI神經血管的保護機制，發現三七總皂苷能促進血管內皮細胞增殖及體內新生血管生成。劉曉梅等〔8〕發現紅景天苷可以減少大鼠腦梗死區突觸結構的破壞和數密度降低，有效保護缺血區腦組織超微結構，減輕CIRI損傷。蒙蘭青等〔9〕探討三七總皂苷對缺血后神經血管單元的影響，實驗結果顯示三七總皂苷干預可有效改善缺血再灌注不同時間點的神經血管單元相關指標。綜上，中藥有效成分可多途徑作用于神經細胞、血管，改善神經血管單元功能，保護CIRI腦組織損傷。

3 拮抗氧化應激反應

腦組織氧自由基防御系統維持氧自由基的產生與消除處于動態平衡。腦組織在缺血缺氧應激狀態下，防御系統遭到破壞，氧自由基病理性增多。氧自由基可與細胞膜上不飽和脂肪酸發生氧化反應，增加血腦屏障的通透性，促進Ca2+內流，引起細胞或線粒體生物膜的破壞，線粒體功能障礙，溶酶體破裂等一系列損傷反應。一氧化氮(NO)由精氨酸的胍基氮在一氧化氮合成酶(NOS)的氧化作用下合成，作為一種神經遞質在腦缺血損傷中發揮著神經毒性和保護神經元的雙重作用。NO在腦組織中NOS主要有三種同種型，內皮結構型NOS(eNOS)、神經元型(nNOS)和誘導型NOS(iNOS)。有研究發現，在腦梗死超早期(＜2 h)nNOS(eNOS)促使NO合成，促進血管擴張，增加腦血流量，但腦缺血超過2 h后，iNOS產生過量的NO加劇神經毒作用，導致神經元遲發性損傷。NO過量產生引起線粒體轉化孔形成、DNA損傷、Ca2+通透的TRPM7通道的活化，以及改變決定性蛋白的功能影響細胞的存活〔10〕。

張現濤等〔11〕觀察銀杏內酯N(GN)對CIRI大鼠腦缺血再灌注后氧化應激反應的保護作用，結果發現GN可以有效減少大鼠血清中和缺血區腦組織中丙二醛(MDA)、NO含量和降低NOS的活性，減輕腦缺血再灌注后氧自由基對神經元細胞的損傷。羅慧英等〔12〕應用當歸揮發油大鼠灌胃預處理后，發現中藥灌胃組大鼠血清中抑制氧自由基生成的超氧比物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽活性升高，而促進氧化反應的NO、NOS、MDA含量明顯降低，進而保護了腦組織，改善了神經功能缺損。趙多明等〔13〕發現胡黃連苷Ⅱ可以顯著降低SOD、NOS活性和MDA含量，提高缺血腦組織的氧化能力，抵抗氧化應激損傷。

4 拮抗免疫反應及Toll樣受體介導的炎癥損傷

炎癥反應是腦缺血損傷機制的主要組成部分之一，在缺血損害或者缺血后腦組織修復過程中發揮了雙向作用〔14〕。炎性細胞、黏附分子、細胞因子和基質金屬蛋白酶等在腦缺血后被激活，相互作用引起炎癥級聯反應導致CIRI，目前研究較多的相關炎癥細胞主要有星形細胞，微膠質細胞、樹突狀細胞和白細胞等，細胞因子主要有腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6、血管黏附分子(VCAM)-1等，趨化因子目前已發現有 20多種〔14〕。目前研究較多的是 Toll受體——核因子(NF)-κB(由P65/P50組成的異源二聚體復合物)信號通路介導的炎癥反應對CIRI機制。Toll樣受體(TLRs)與其內源性或外源性配體二聚體化后招募髓樣分化因子88(MyD88)，激活MyD88依賴性信號通道，刺激白介素受體相關激酶(IRAK)1自主磷酸化，激活 IKB激酶，開放絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，導致被解除抑制的NF-κB和AP-1轉錄因子的活化啟動下游靶基因轉錄(如TNF-α，IL-1，IL-8等)。TNF-α是NF-κB活化的重要刺激物之一，可促進IL-6等炎性因子的釋放〔15〕。Guo等〔16〕觀察芍藥苷(PF)對 NF-κB 介導 CIRI促炎因子(TNF-α、IL-1β等)的影響，實驗結果顯示PF治療有效改善了大鼠神經功能，減少了腦梗死的面積，保護了神經元的損傷;其機制主要是PF抑制NF-κB信號通路，減少促炎因子(TNF-α、IL-1β等)的活化。劉永剛等〔17〕觀察分析銀杏內酯B對大鼠CIRI的影響，結果發現銀杏內酯B可有效減少大鼠腦組織和血清中的炎癥相關因子，且呈現明顯劑量-效應依賴關系;銀杏內酯B可有效減少炎性介質釋放，炎性細胞的浸潤，抑制再灌注后缺血區腦組織的炎癥反應。鄒毅清等〔18〕發現紅景天苷可以有效減少腦缺血再灌注大鼠血中炎癥因子TNF-α和IL-6濃度以及抑制海馬區髓過氧化物酶(MPO)和NF-κB活性，有效地保護了大鼠CIRI反應。

5 抑制鈣離子內流

細胞內外離子濃度平衡可有效調控細胞功能，Ca2+的調控作用尤為重要。細胞內Ca2+主要儲存在線粒體和肌質網中，Ca2+作為第二信使有效調節細胞的生理功能。NMDA受體作為谷氨酸的亞型受體，另有研究顯示還存在著其他非谷氨酸依賴性Ca2+通路，主要有酸感受離子通道(ASICs)、瞬時受體電位通道(TRPM2、7)和 Na+-Ca2+交換體(NCX)〔19〕。CIRI后依賴型和非依賴型Ca2+通道均被激活，介導Ca2+內流引起胞質內Ca2+超載。細胞內Ca2+超載可激活蛋白水解酶和磷脂酶A2促使氧自由基產生，氧自由基也可以促進Ca2+內流。線粒體內Ca2+超載，造成線粒體通透性增加，降低線粒體膜電位，導致神經元細胞凋級聯損傷反應。此外鈣調蛋白(CaM)為NOS合成NO的必要結構，Ca2+超載也會引起NO含量的增加，增加NO對神經元的神經毒作用。

由于Ca2+超載作為CIRI級聯反應的中間環節，拮抗Ca2+的藥物研究成為治療CIRI的一個主要靶點。中藥有效成分可通過調節鈣調蛋白，抑制興奮氨基酸的釋放，減少氧自由基和NO的生成，多環節地抑制Ca2+超載。許勇俊等〔19〕發現關蒼術乙酰乙酯提取物可有效降低大鼠腦缺血再灌注后血清中MDA含量和腦細胞內Ca2+濃度，減少缺血再灌注后應激反應對腦組織的損傷。劉詩旭等〔20〕探索丹參酮B鈉鹽對大鼠局灶性CIRI的保護作用，發現丹參酮B可以顯著減少細胞內Ca2+濃度，抑制Ca2+超載產生神經毒性。

6 抑制神經元凋亡基因的表達

細胞凋亡是興奮氨基酸、氧自由基、炎癥反應等CIRI多環節作用的最終結果。細胞凋亡目前研究主要分為2種:內源性凋亡，即線粒體凋亡主要是多種凋亡誘導因子如細胞色素C、caspase蛋白等激活，導致線粒體損傷，功能喪失;外源性凋亡路徑，又稱死亡受體路徑，其細胞表面死亡受體如TNF受體(TNFR)-1、Fas受體、p75神經營養素受體(p75NTR)。死亡受體形成死亡誘導信號復合物間接通過線粒體途徑方式誘導細胞凋亡。

趙秋振等〔21〕研究川芎嗪(TMP)對CIRI海馬神經元的Bcl-2相關X蛋白(Bax)轉錄的影響，發現川芎嗪治療組Bax陽性細胞數明顯少于CIRI模型組。實驗數據表明TMP可以減少Bax轉錄，協調了B淋巴細胞瘤(Bcl)-2基因抑制細胞凋亡與Bax基因促細胞凋亡分子之間的平衡，進而減少了CIRI后神經細胞的凋亡，保護了腦組織的損傷。王瓊等〔22〕發現三七總皂苷抑制腦細胞凋亡的作用可能與促進抑制凋亡蛋白X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表達和抑制促凋亡蛋白第二個線粒體源的半胱天冬蛋白酶激活物(Smac)的表達的機制有關。王全宏等〔23〕發現燈盞花素治療組大鼠海馬蛋白激酶B(Akt)陽性表達明顯升高，調節了細胞增殖分化凋亡信號通路，起到腦保護的作用。

7小結

綜上所述，同一中藥有效成分可多層次多靶向保護CIRI。雖然目前大家對CIRI保護作用的研究已經比較深入，但是仍然存在著一些問題。首先，小樣本低水平實驗重復較多，缺乏對損傷機制和保護機制新進展的研究。其次，CIRI是多環節相互作用的損傷。目前中醫研究僅針對某一環節進行研究，缺乏對保護CIRI級聯機制的研究;并且，中醫注重整體思想，強調辨證論治，因此須增加對中醫復方或多個中藥有效成分聯合保護機制的研究。目前中藥單體或有效成分研究較多且雜亂，缺乏對中藥有效成分篩選實驗。再者，CIRI實驗動物主要是成年大鼠，忽略了臨床上年齡因素在病因中的作用，因而使得實驗研究不夠全面，實驗研究結果與臨床實踐有較大的差距。目前對于中醫藥保護CIRI的分子生物研究雖然較為薄弱，但是隨著科技的進步，以及人們對CIRI機制認知水平的提高，中藥保護的作用機制研究必將更加透徹，更加有利于中藥治療CIRI的臨床實驗研究。

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