人中性粒細胞對結核分枝桿菌殺傷活性的檢測方法

賀文欣　姜麗娜蔡　輝李柏青(蚌埠醫學院組織學與胚胎學教研室，安徽　蚌埠　233030)

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人中性粒細胞對結核分枝桿菌殺傷活性的檢測方法

賀文欣姜麗娜1蔡輝1李柏青1(蚌埠醫學院組織學與胚胎學教研室，安徽蚌埠233030)

〔摘要〕目的探討用FDA標記Mtb的最佳濃度，觀察不同化學試劑和溫度對FDA標記率的影響及PMNs殺傷Mtb的活性。方法用不同濃度熒光素二醋酸酯(FDA)標記Mtb，選取最佳標記濃度，在0℃冰浴，37℃、65℃和95℃水浴中孵育30 min，或與不同百分比的乙醇、甲醛和多聚甲醛(PFA)試劑在室溫下孵育30 min后洗滌，用流式細胞術檢測標記率和熒光強度(MFI); Percoll分離獲得PMNs與FDA標記的Mtb于37℃孵育7 min，洗滌，加入自體血清，置37℃孵育0～60 min，計算PMNs對Mtb的殺傷率。結果Mtb用不同濃度FDA在PBS中標記的標記率分別從由85%增加到99%，MFI分別從45增加到1 506;在0℃冰浴，37℃、65℃、95℃水浴作用30 min后，FDA-Mtb的標記率從0℃的99%下降至95℃的0. 21%，MFI從0℃的2 015下降至95℃時的87; FDA標記的Mtb與不同比例的常規化學試劑乙醇、甲醛、多聚甲醛分別作用30 min后，FDA-Mtb的MFI在各組均顯著降低(P＜0. 01); FDA標記的Mtb與分離PMNs在37℃作用0 min、10 min、30 min和60 min，PMNs殺傷Mtb的百分率分別是11. 37%、12. 02%、27. 20%、58. 44%。結論流式細胞術能快速準確地檢測PMN對FDA標記Mtb的殺傷活性，且殺傷活性隨時間延長而增強。

〔關鍵詞〕中性粒細胞;結核分枝桿菌

1蚌埠醫學院感染與免疫安徽省重點實驗室

第一作者:賀文欣(1980-)，男，碩士，講師，主要從事細胞免疫、神經生物學研究。

中性粒細胞即多形核細胞(PMNs)，是機體最重要的炎性細胞，當外來病原體進入機體時，PMNs就會向病原體處集結，進行吞噬活動，繼而消化和降解病原體，發揮天然免疫清除病原體的效應〔1～3〕。以往的研究表明，機體感染結核分枝桿菌(Mtb)后，發揮抗結核免疫主要是細胞免疫，且在急性結核病發病早期，PMNs首先吞噬Mtb，并且PMNs是活動性肺結核病人感染過程中占最主導地位的吞噬細胞〔4～6〕，但其發揮的生物學效應卻絕不僅僅是簡單的吞噬作用。以往用于評價Mtb殺傷活性的方法由于受到Mtb生長緩慢的限制，實驗周期較長，而且操作繁瑣，影響因素較多，因此并不理想。據此，尋找新的檢測Mtb殺傷活性的方法尤為重要。本文希望為檢測Mtb殺傷活性尋找一種快速簡便的方法。

1　材料與方法

1. 1 Mtb的培養和懸液的制備Mtb H37Ra(批號: 9302025)，購于中國藥品生物制品檢定所北京菌種保藏中心。將Mtb H37Ra培養于含有10%小牛血清的改良蘇通氏液體培養基中，并置于37℃恒溫培養箱內，當達到對數生長期時(約1個月)，用無菌接種環取出部分菌接種到羅琴氏固體培養基上培養。當固體培養基上長出新鮮成蔟的Mtb時，用無菌接種環取少許Mtb置于EP管中，用研磨棒進行反復研磨，加入生理鹽水洗滌2次，離心10 000 r/min，2 min，再用1 ml注射器加入少許0. 9% NaCl對細菌懸液反復吹打，使其分散為單個菌懸液。分光光度計600 nm處檢測菌液濃度，用0. 9% NaCl調細菌濃度為5× 108/ml，分裝EP管中，置于4℃冰箱待用。

1. 2熒光素標記Mtb的制備取Mtb懸液，離心13 000 r/min，2 min，用磷酸鹽緩沖液PBS(pH7. 2)配成濃度為5×108/ml的懸液，加入DMSO配制的FDA溶液(100 μmol/L)，FDA終濃度為0. 025～2. 0 μmol/L，然后置37℃25 min后，離心13 000 r/min，2 min，棄上清，PBS洗滌2次;配成濃度為5× 108/ml細菌懸液，避光保存于4℃備用。流式細胞術檢測Mtb標記率及FDA標記的Mtb存活率，取5×108/ml未標記Mtb菌液100 μl，加入DMSO配制的FDA溶液(100 μM)1 μl，然后置37℃25 min后，離心13 000 r/min，2 min，棄上清，PBS洗滌2次，用流式細胞儀檢測Mtb的FDA標記率。

1. 3流式細胞術檢測溫度對FDA標記的Mtb存活率的影響將存活率＞95%的FDA標記的Mtb 100 μl分別放置在0℃冰浴，37℃、65℃和95℃水浴中，30 min后取出，PBS洗滌2次，每次離心13 000 r/min，2 min，棄上清，重懸，再用流式細胞儀檢測。每個樣品收集1×104個細胞，檢測Mtb的FDA陽性率和陰性率。

1. 4流式細胞術檢測不同常規化學試劑對FDA標記的Mtb存活率的影響將存活率＞95%的FDA標記的Mtb 100 μl加入1. 5 ml EP管中，每管各加入終比例為55%、65%、75%乙醇、50%、75%、95%甲醛和0. 5%、1%、2%的多聚甲醛試劑，室溫下放置30 min，PBS洗滌2次，每次離心13 000 r/min，2 min，棄上清，重懸，再用流式細胞儀檢測。

1. 5 PMN的分離采集健康自愿者(均來自本院健康教職工和學生)外周靜脈血5 ml，經1 500 r/min水平離心5 min后，取紅細胞上的“白膜”層，用1 ml 1640稀釋，繼續在玻璃離心試管中依次加入75%與60% Percoll液和1640稀釋的“白膜”層，三者體積比為2∶2∶1，2 000 r/min水平離心20 min，吸取60%與75% Percoll液的界面層中PMN，用完全1640充分洗脫Percoll膠粒后，加入滅菌純凈水2 ml振搖20～30 s，迅速加入2 ml 1. 8%NaCl溶液混勻，1 500 r/min水平離心5 min后，用完全1640制成濃度為1×106/ml的細胞懸液。

1. 6流式細胞術檢測人外周血分離的PMN對FDA標記Mtb的殺傷率取流式管，每管加入已分離的1×106/ml的PMN細胞懸液25 μl，再加入5×108/ml FDA標記的Mtb菌液20 μl，混勻后置37℃水浴，7 min后迅速取出，加冰冷的PBS洗滌1次后再用冰冷的RPMI1640洗滌一次，后加入自體血清20 μl/管，然后分成兩組置0℃冰浴和37℃水浴，每管分別在0、10、30和60 min時間段，立即加入100 μl 1%的脫氧膽酸鈉(DOC)并在原溫度下保持5 min，再加入無菌三蒸水，250 μl/管，2 min，用流式細胞儀檢測。同時設定全血加入未標記細菌組(空白對照)。

1. 7統計學處理采用SPSS16. 0軟件行單因素方差分析(one-way ANOVA)及q檢驗。

2　結果

2. 1不同濃度熒光素FDA對Mtb標記率和平均熒光強度(MFI)的影響不同濃度FDA標記Mtb標記率0. 1、0. 5、1. 0 μmol/L FDA的標記率分別為83. 33%、99. 56%、99. 67%。有顯著性差異(P＜0. 01)，隨著FDA濃度增加標記率逐漸增高。不同濃度FDA標記的Mtb-MFI有顯著性差異(P＜0. 01)，FDA濃度為0. 01、0. 5、1. 0 μmol/L時MFI分別為49. 73±8. 53、208. 64±2. 93、784. 75±15. 94、1 463. 82±33. 49。

2. 2溫度對FDA標記的Mtb存活率的影響存活率＞95%的FDA標記的Mtb 100 μl在不同溫度下作用30 min后，隨著溫度的升高，不同溫度對FDA-Mtb的標記率即存活率有顯著影響(P＜0. 01)，標記率隨溫度增加而降低;而且，用不同溫度作用FDA-Mtb時，溫度對MFI也有不同影響。不同溫度對FDA標記的Mtb-MFI有顯著性差異(P＜0. 01)，0℃、37℃、65℃、95℃時mFI分別為200 1. 64±594. 83，1 038. 94±89. 47，64. 85±11. 72，48. 42±19. 03。

2. 3不同常規化學試劑對FDA標記的Mtb存活率的影響存活率＞95%的FDA標記的Mtb 100 μl在不同化學試劑作用30 min后，發現隨著加入試劑百分率的增加，同一化學試劑對FDA-Mtb的MFI有顯著影響(P＜0. 01)，在乙醇組，MFI從對照組的1 597下降至325;甲醛組下降至118，多聚甲醛組下降至185，MFI均隨著加入試劑百分率的增加而下降。

2. 4分離PMN對FDA標記的Mtb的殺傷的時間動力學Mtb與分離PMN在37℃作用0、10、30和60 min，PMN殺傷Mtb的百分率分別是11. 37、12. 02、27. 20、58. 44。兩者在37℃作用0～60 min PMN殺傷Mtb的百分率呈遞增趨勢(P＜0. 01)。

3　討論

PMN作為職業吞噬細胞，在機體的抗感染免疫中扮演著重要的角色，是機體最重要的炎性細胞，在急性感染早期發揮重要的作用。在炎癥反應中，PMN到達炎癥發生的部位，其表面有可識別細菌的受體，吞噬病原體的過程包括趨化、識別結合、內吞、氧依賴性殺傷和氧非依賴性殺傷等。以往的研究表明，在急性結核病發病早期，PMNs首先吞噬Mtb〔7～9〕，并且PMNs是活動性肺結核病人感染過程中占最主導地位的吞噬細胞，而其發揮的生物學效應卻絕不僅僅是簡單的吞噬作用，要比以往研究的其所發揮的作用復雜得多。Scott等〔10〕曾經建立了較為新型的檢測Mtb藥敏實驗的方法，即通過熒光素二醋酸乙酯(FDA)標記Mtb，用流式細胞儀檢測抗Mtb藥物活性，操作簡單，重復性好，結果準確。特別是其操作時間短暫，24 h內就可以獲得結果。FDA可作為活細胞染料，能夠輕易地通過細胞膜進入細胞內，被細胞內存在的酯酶水解，保留在細胞內呈較強的綠色熒光，而壞死和凋亡的細胞，則不發熒光。

通過本文實驗，我們明確了用FDA來標記Mtb，都可以用流式細胞儀快速準確地檢測其標記率和MFI，并且標記率和MFI反映的就是Mtb的存活率。PMN殺傷Mtb的量隨時間呈增加趨勢，且在30 min左右殺傷值增加較為明顯。實驗中體會到，PMN吞噬和殺傷Mtb是連續的過程，并且受溫度影響較大，因此控制整個實驗溫度對實驗結果甚為重要。洗滌的過程全部用4℃的冰冷的PBS進行，在全血組用氯化銨溶解紅細胞時，將操作放置在15℃～18℃的水浴中進行，這樣也能避免復雜操作引起的細胞活化而導致檢測結果的改變。用1%的脫氧膽酸鈉(DOC)和冰冷三蒸水來使殘留的熒光素與PMN分離，并且破裂細胞使其漏出，以保證實驗結果的準確性。用流式細胞儀檢測PMN對Mtb殺傷活性的影響，所需標本量少，檢測快速、簡單，準確。總之，本實驗通過用熒光染料和流式細胞術，檢測了FDA對Mtb的標記率，以及體外因素對標記率的影響，并且用流式細胞術檢測了分離PMN對不熒光素標記的Mtb殺傷的時間動力學，為今后本實驗的流式細胞術研究和臨床抗結核的輔助治療提供了依據。

4參考文獻

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〔2014-12-25修回〕

(編輯徐杰)

基金項目:感染與免疫安徽省重點實驗室(蚌埠醫學院)開放課題(BYKL1302)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5689-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 005

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R378