乳腺腫瘤細胞對微環境成纖維細胞基因表達的影響

徐學清張　貝(南方醫科大學藥學院，廣東廣州　510515)

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乳腺腫瘤細胞對微環境成纖維細胞基因表達的影響

徐學清張貝
(南方醫科大學藥學院，廣東廣州510515)

關鍵詞:乳腺癌;成纖維細胞;腫瘤微環境;基質;基因本體;基因表達;微陣列

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.029.html

惡性腫瘤的發生不僅僅是腫瘤細胞自身的問題，而且與腫瘤微環境有密切關系。目前對乳腺癌的研究更多關注基質微環境在正常乳腺發育、原位癌發生、腫瘤生長和轉移中的作用［1－2］。在本研究中，我們利用有限的細胞系觀察乳腺腫瘤細胞如何改變成纖維細胞的基因表達譜和這種改變是否與他們的侵襲和轉移能力相關。該研究將有助于理解乳腺腫瘤細胞侵襲和轉移的機制和鑒定與他們密切相關的基因。

1　材料與方法

1.1材料Poly-A RNA Control kit購自Affymetrix公司; TRIzol RNA抽提試劑購自Invitrogen公司; RNeasy MinElute Cleanup Kit和QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit購自Qiagen公司; HS68人皮膚成纖維細胞、MCF-7、MDA-MB-231乳腺腫瘤細胞和MCF-10A上皮細胞從ATCC購買;胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養液購自美國Gibco公司。

1.2方法

1.2.1成纖維細胞的條件培養MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A細胞被培養至70%～80%滿后，用無血清DMEM繼續培養72 h，收集培養液，12 000 r·min－1離心10 min，收集上清液作為條件培養基組分。HS68細胞被培養至70% ～80%滿后用無血清DMEM繼續培養4 h，然后用含10% MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A培養液上清的DMEM繼續分別培養48 h，收集HS68細胞用于基因表達分析。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成用TRIzol抽提條件培養48 h后的HS68成纖維細胞總RNA后，按照說明書用RNeasy MinElute Cleanup Kit純化，得到的mRNA經Poly-A RNA Control Kit反轉錄成雙鏈cDNA并純化后寄送到Affymetrix公司進行microarray分析。

1.2.3 Microarray數據分析Affymetrix公司提供的原始基因數據文件檢測Call值為P的數據才被用于進一步分析。當P＜0. 05、倍數變化數≥2或者＜－2的基因被認為表達有差異。聚類分析采用Spearman相關分析和平均連鎖層次聚類分析法進行;本體鑒定和通路分析用GenMAPP和Gen-MAPPFinder程序鑒定。

1.2.4實時定量PCR以與芯片雜交相同的RNA為模板和GAPDH為內參，用QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit在ABI PRISMTM 7900 PCR儀上進行實時定量PCR檢測CXCL1、CXCL2、IL-6、IL-8、CCL2、IL-1B的表達，每個樣本重復測定3次，目的基因相對表達量的計算用ABI公司的7500 Version 2.0.1軟件完成，采用ΔΔCt法計算基因表達變化倍數。

2　結果

2.1基因表達譜分析本研究從MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A細胞上清條件培養的成纖維細胞雜交芯片上檢測到23062、23364和23736個探針。與對照組比，這3種處理的成纖維細胞內明顯上調和下調的基因數分別為484、439 和1121以及629、587和1138。并且兩種腫瘤細胞上清處理組的基因表達譜彼此簇集，與MCF-10A細胞處理組明顯不同。

在3種處理的成纖維細胞內，與細胞周期、細胞組分、細胞增殖與生長相關的基因表達都下調了，并且下調基因本體和信號通路幾乎完全相似。但3種處理導致成纖維細胞內與細胞因子、免疫反應和炎癥反應相關的基因表達被上調。例如，在兩種腫瘤細胞上清處理的成纖維細胞內，微陣列檢測到15～50個分別與防御反應、系統免疫、細胞因子、免疫反應和趨化作用等生物學過程和分子功能相關的基因。但對外部刺激的反應有最大Z積分，分別為5. 023和5. 937。微陣列數據中的49和53個基因代表了該通路8%和9%的成員;炎癥反應生物學過程中分別有19和24個成員的基因在微陣列中被鑒定，代表了該類成員的6%和10%。兩種腫瘤細胞上清處理的成纖維細胞內Z積分位于前10的上調信號通路都包含Hs Cytokines and Inflammatory Response Biocarta、Hs Hypertrophy model、Hs 2-Tissues-Muscle Fat and Connective、Hs 1-Tissue-Muscle fat and connective、Complement and Coagulation Cascades。此外，兩種處理的成纖維細胞有幾乎完全相同的下調基因本體和信號通路。在MCF-10A處理組內，防御反應有最大Z積分(5.008)，57個被微陣列檢測到的基因占該通路成員的10%。并且微陣列分別檢測到46、52和13與炎癥反應、免疫反應和急性炎性反應相關的基因。但是它的Z積分前12的基因本體目錄中僅inflammatory response，immune response和extracellular space與MCF-7、MDA-MB-231處理組相同。信號通路中僅Hs 1-Tissue-Muscle fat and connective與后二者相同。盡管許多與趨化因子、細胞因子、生長因子、炎癥因子和基質金屬蛋白酶等相關的基因在3種處理的成纖維細胞內有相對一致的明顯變化。但不同是，在兩種腫瘤細胞上清處理的成纖維細胞內，FGF2、FGF13、PDGFA、LIF、TNFRSF9、IL1A和VCAM1明顯上調;而在MCF-10A細胞上清處理的長纖維細胞內，NFATC4、C1RL、TNFSF13B、TNFSF10、TNFRSF19、BDKRB2、BDKRB1、IL-15、IL1R1、IL1R2、GRB14、FGF11、PGF、CXCL12、

CXCR7、TGFB3、IFNGR1的基因表達明顯增長; IL13RA2、TNFRSF12A、TGFB2、VEGFC、FGF5、MMP1的基因表達明顯下降。

2.2實時定量PCR驗證所驗證的6個基因的差異倍數均達到顯著水平(P＜0. 05)，相對于沒有處理的成纖維細胞，這些基因的mRNA在3種處理的成纖維細胞內明顯增長，變化倍數4. 46～35. 01，這些結果證實了基因芯片的結果。并且就變化倍數而言，實時定量PCR的結果與基因表達位點列陣間顯示了比較好的相關性。

3　討論

腫瘤微環境內的成分與腫瘤細胞間相互影響。腫瘤細胞能調節環境中宿主細胞基因的表達以利于自身的侵襲和轉移。3種細胞上清刺激的成纖維細胞的基因表達譜在本研究中都發生了明顯的改變，并且這種變化譜鏡像反映了3種細胞的侵襲能力。首先，癌癥與炎癥密切相關，宿主腫瘤反應能導致許多促炎癥過程［3］。炎性因子的變化倍數以及與他們相關的通路在腫瘤細胞上清處理組比在MCF-10A細胞上清處理組內更大和有更高的Z積分。其次，LIF、TNFRS9、FGF2、FGF13、PDGFA等有利于腫瘤侵襲和轉移的基因僅在腫瘤細胞上清刺激的成纖維細胞內被明顯上調，而在這種變化在MCF-10A處理組內沒有觀察到。NFATC4和CXCL12表達的上調和MMP1、TGFB、IL-13、VEGFC、FGF5的表達下降等不利于腫瘤侵襲和轉移的變化僅在在MCF-10A處理成纖維細胞內出現。因此，3種細胞上清能不同程度地調節成纖維細胞表達細胞因子、趨化因子、炎性因子等的表達，促進基質降解、血管生成、腫瘤增殖、侵襲和遷移。他們改變成纖維細胞基因表達的能力和他們的侵襲和轉移能力成正相關。該研究強調了宿主基質在腫瘤遷移中的重要作用。

參考文獻:

［1］Esposito A，Curigliano G.Tumor-stroma crosstalk: targeting stroma in breast cancer［J］.Curr Opin Oncol，2014，26(6): 551－5.

［2］陳淑嫻，朱瑞宇，付強，等.人乳腺癌細胞及其耐藥細胞轉錄因子表達的差異［J］.中國藥理學通報，2012，28(9): 1257－61.

［2］Chen S X，Zhu R Y，Fu Q，et al.The transcription differences of mammary breast cancer cell and its adriamycin-resistant cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(9): 1257－61.

［3］Ham M，Moon A.Inflammatory and microenvironmental factors involved in breast cancer progression［J］.Arch Pharm Res，2013，36(12):1419－31.

Effect of breast tumor cells on the gene expression profiles of fibroblasts in microenvironment

XU Xue-qing，ZHANG Bei
(School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)

中國圖書分類號: R329.24; R73.02; R737.9

Key words:breast cancer; fibroblast; tumor microenvironment; stroma; gene ontology; gene expression; microarray

作者簡介:徐學清(1978－)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向:微生物與生化藥學，通訊作者，E-mail: xu2003@ smu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 31370782);廣東省優秀青年教師培養計劃資助項目

收稿日期:2015－01－17，修回日期:2015－02－05

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1032－02

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.029