動物試驗替代方法在獸用疫苗檢驗中的應用概況

王曉卉，李 翠，蔣 卉，張秀英，溫 芳，陸連壽，王在時

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

動物試驗替代方法在獸用疫苗檢驗中的應用概況

王曉卉，李 翠，蔣 卉，張秀英，溫 芳，陸連壽，王在時?

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

介紹了動物試驗替代方法的含義及其在國內外的發展情況，并從實驗動物替代法、血清學替代法和疫苗抗原定量法三方面重點介紹了動物試驗替代方法在獸用疫苗檢驗中的應用情況、優勢和意義，以期為獸用疫苗檢驗替代方法研究提供參考。

動物試驗替代方法；獸用疫苗檢驗

1 動物試驗替代方法概述

1959年，在英國動物學家William與Rex共同出版的專著《The Principles of Humane Experimental Technique》中，最早提出了減少（Reduction）、替代（Replacement）、優化（Refinement）（簡稱 3R）原則［1］，其具體的含義為：減少科學研究活動中的動物使用量，探索能夠達到相同目的或獲得相同結果的動物試驗替代方法，采用一切可行的技術和手段，使動物免受試驗所造成的痛苦、不安和疼痛或／和改善生活環境，從而提高動物生存質量的優化方法［2］。1978年，David Smyth教授出版了《動物試驗替代方法（Alternatives to Animal Experiments）》一書，提出用替代（Alternatives）來給3R做了概括［3］。3R是現今動物試驗替代方法（Alternative Methods）的核心和主要研究內容，是動物試驗替代方法的發展方向，有時就是替代試驗代名詞［4］。

為了推動動物替代技術的發展，國外成立了許多相關的研究組織和管理機構，并投入大量經費資助相關的科學研究，以促進新技術新方法的開發和應用，如美國霍普金斯動物試驗替代方法研究中心（The Johns Hopkins center for Alternatives to Animal Testing，CAAT）、歐洲替代方法驗證中心（European center forthe validation ofalternative methods，ECVAM）、美國機構間替代方法評價協調委員會（The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Method，ICCVAM）等等。除了設立機構之外，許多國家還都制定了動物保護相關法規或發布管理條例、行業規范對動物試驗予以約束。如1876年英國頒布的世界上第一部涉及有動物試驗內容的法規《防止虐待動物法》［3］，美國《動物和動物產品法》和《人道主義飼養和使用實驗動物的公共衛生方針》也明確規定了3R原則在動物試驗方面的應用［5］。

我國動物福利起步較晚，與國外相比，我國在這方面差距較大，但目前也正在逐步與國際接軌。1997年，原國家科委等四部委聯合發布的《關于“九五”期間實驗動物發展的若干意見》，是第一次把3Rs的基本概念寫進實驗動物工作管理和科技發展的法規性文件，并把“實驗動物替代研究”列為“實驗動物基礎性研究”的重點內容［6］。2001年科學技術部發布的《科研條件建設“十五”發展綱要》中，明確提出“推動建立與國際接軌的動物福利保障制度”，并把這一工作納入“全面推行實驗動物法制化管理”的重要內容之一［7］。2006年我國發布《關于善待實驗動物的指導性意見》，首次對實驗動物福利提出指導性意見。我國也于2006年首先建立了中國替代方法研究評價中心（Chinese Center for Alternatives Research＆Evaluation，CCARE），旨在為中國的替代方法研究提供信息交流、法規介紹和技術服務的平臺，并于2007年開通了中國替代方法研究評價中心共識平臺（www.vitrotox.com），通過這個平臺有效推動了“3R”原則的社會認知、推進替代方法的研究和技術進步、實現資源的共享和信息自由交流［8］。中國獸醫藥品監察所也已于2013年8月起開始實施對動物試驗的動物福利倫理審查申請程序。

隨著動物福利受到愈加廣泛的關注，國內外關于動物試驗替代方法的研究也越來越多，主要研究領域有：化學品的毒理性研究；藥物和疫苗產品的研發、評價和質量控制；食品中化學物質遺傳毒性、致癌性的監管評估；化妝品的安全評價［9］。

3R原則受到了普遍關注，加強動物試驗替代方法研究也已成為生命科學工作者的共識。許多專家強調，實驗動物及其相關研究是一項基礎性強、高新技術密集的研究領域，其發展和應用程度已成為衡量一個國家或地區科學技術水平高低的重要標志之一，我國的科學研究、新醫藥開發等領域要走在世界前沿，就要重視和開展實驗動物的研究，加強動物試驗替代方法的研究［10］。

2 動物試驗替代方法在獸用疫苗檢驗中的應用

疫苗接種是預防和控制傳染病的重要武器，自人類發現疫苗的免疫作用至今，疫苗為人類和動物的健康做出了重要貢獻。獸用疫苗可以預防動物免受許多傳染性疾病的侵害，更重要的是，獸用疫苗通過對一些人畜共患病的防控，對人類健康的貢獻也不可小覷，如獸用狂犬病疫苗。同時，獸用疫苗還是預防一些外來病的重要手段，如口蹄疫、新型流感病毒等［11］。合格的疫苗一定要滿足安全性、有效性的基本要求，這就決定了疫苗必須經過安全檢驗和效力檢驗。然而，在獸用疫苗的質量評價中，尤其是在評價獸用疫苗免疫效力的各種方法中，基于免疫學原理的動物免疫攻毒法等動物試驗法仍然是最令人信服的獸用疫苗免疫效力評價方法，即動物試驗很大程度上在獸用疫苗的免疫評價中仍發揮著不可替代的作用。但對于獸用疫苗檢驗中所用動物種類多、數量大的情況，動物試驗法檢驗疫苗效力存在很多問題，主要有：動物（尤其是一些大動物和特殊動物）供應不足；動物標準不完善，監管不到位，質量得不到保證；動物試驗過于頻繁，動物福利未得到有效關注［12］。

國內外一直在努力探索應用替代方法檢驗獸用疫苗的質量，也取得了許多成果。目前，對于活疫苗的效力檢驗已廣泛應用了替代方法，也有一些滅活苗應用了替代方法進行檢驗，大大降低了疫苗檢驗的成本和效率。迄今為止，應用較多的替代方法主要有：實驗動物替代法、血清學替代法和疫苗抗原定量法。

2.1 實驗動物替代法 用于獸用疫苗檢驗的實驗動物中，一些小型動物，如雞、鼠、兔等的供應較為充足，且易于獲得符合試驗要求的動物。但一些較大的動物，如豬、馬、牛、羊等，和一些特殊動物，如貂、狐等的供應較難滿足試驗需要，且往往需要實驗人員到養殖場甚至是散養戶去一一篩選符合試驗要求的陰性動物。嚴格意義上，這樣的動物其實已不能稱之為實驗動物。而且由于國家對一些重大動物疫病實行強制免疫政策，篩選符合某些要求的陰性動物較有難度，如豬藍耳病抗體陰性豬。因此，很多疫苗在檢驗中尋找了小型動物與本動物之間的平行關系，并用小型動物替代本動物進行檢驗，以節約成本，降低難度，也響應了3R原則中的“減少”要求。如豬瘟兔化弱毒疫苗的效力檢驗，應用兔體定型熱法進行，替代了用陰性豬進行的強毒攻擊，在提高檢驗效率的同時，也減少了強毒污染帶來的安全隱患。再如豬圓環病毒 2型滅活苗（SH株）的效力檢驗，應用小鼠免疫試驗法，既替代了攻毒試驗，也替代了豬的使用，解決了實際檢驗中圓環陰性豬篩選難的問題［13］。除此以外，雞新城疫活疫苗、雞痘活疫苗等采用雞胚檢驗法替代雞檢法也是實驗動物替代法的應用。雖然在獸藥典中，很多應用了實驗動物替代法進行效力檢驗的產品，本動物免疫攻毒法仍作為備選方法之一列出［14］，但在實際中已很少應用。

2.2 血清學替代法 對于許多滅活苗成品效力檢驗，由于經過滅活加之佐劑的干擾，很難像活疫苗那樣用半數感染量等方法進行抗原滴度的測定，因此，許多滅活疫苗不得不使用本動物攻毒法檢驗效力。而攻毒法無法做到動物福利的要求，而且需要試驗和飼養場所嚴格防護，并嚴格處理動物排泄物、尸體等，從各個環節防止病原污染環境帶來安全隱患。因此，一些滅活苗產品采用了血清學方法作為替代方法，即用疫苗免疫動物后，采集免疫血清，測定其中的特異性抗體滴度，以滴度的高低作為衡量標準。該方法減少了病毒擴散的危險，消除了攻毒給動物帶來的痛苦，還節省了時間。從疫苗監控上看，該方法還將攻毒試驗的“定性”判定（死亡或出現臨床癥狀），轉向了“定量”判定，更加準確，還可以將血清樣品冷凍保存，方便復檢［15］。可見，血清學替代法體現了3R原則的“優化”要求。如雞新城疫、減蛋綜合征二聯滅活疫苗，該疫苗中的兩種抗原均用血清學方法，測定免疫雞血清中的HI抗體效價來檢驗疫苗效力［14］。

2.3 疫苗抗原定量法 對于疫苗來說，無論活疫苗還是滅活疫苗，其效力的最終決定因素都是其中抗原的含量。在活疫苗的效力檢驗中，通過在體外對抗原進行定量來評價疫苗質量的方法，已經很大程度上替代了免疫攻毒法，常用的方法有：利用微量細胞培養，觀察細胞病變（CPE），計算細胞培養物的半數組織培養物感染量（TCID50），如豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗；對于不致細胞病變的抗原，可利用免疫熒光技術，計算半數感染量（FAID50）；利用某些病毒可在細胞單層上形成蝕斑的特性，通過蝕斑計數計算疫苗的蝕斑形成單位數（PFU），如雞馬立克氏病活疫苗；對于有的細菌活疫苗，可通過活菌計數計算菌落形成單位數（CFU），如布氏桿菌病活疫苗［14］。這些試驗常常用到Reed－Muench法或Karber法進行定量，并建立了與傳統動物檢驗法的相關性，且在質量控制中通常保留一定的緩沖范圍，以盡量減小檢驗誤差和疫苗保存期間的效力損失，在美國，這一緩沖范圍通常分別為100.7TCID50和100.5TCID50［16］。疫苗抗原定量法的優點是不言而喻的，它最大程度的擺脫了動物試驗的束縛，大大節約了檢驗成本、縮短了試驗時間、并避免了動物個體差異造成的誤差，同時也完全實現了動物福利3R原則的“替代”要求。

然而，對于滅活苗的成品效力檢驗，以上方法就難以勝任了，只能在滅活前對其進行抗原定量。由于滅活苗經過滅活，其免疫效力可以說幾乎完全由抗原含量決定，而不需要像活疫苗那樣依賴抗原活性經過一個體內的增殖過程來體現效力。但受活性和佐劑的影響，對滅活苗進行準確的抗原定量仍有一定難度。但仍有一些滅活苗產品實現了抗原定量法評價效力，其中，ELISA方法應用最為普遍。如美國輝瑞公司生產的豬支原體肺炎滅活疫苗，將疫苗破乳處理后，將水相中的抗原稀釋后包被反應板，采用ELISA方法測定疫苗中所含抗原的相對效力單位值［17］；美國勃林格殷格翰動物保健有限公司生產的豬圓環病毒2型桿狀病毒活載體滅活疫苗，采用了新型水溶性佐劑，不需破乳處理即可直接利用ELISA方法測定相對效力值［18］。利用ELISA抗原定量方法評價滅活苗效力離不開參考疫苗的橋梁作用，即參考疫苗經過了本動物實驗等傳統方法檢驗，并與替代方法進行了平行關系分析，其效力值是特異性、免疫原性、抗原含量符合性和其免疫保護性等生物學特性綜合反映的結果，在替代方法中，參考疫苗代表了傳統方法，實現了效力檢驗的等效替代，根據被檢疫苗與參考疫苗平行對比檢驗后，經計算而形成相關效力單位值（RF值），對被檢疫苗的抗原含量、免疫抗體效價和保護效力是否符合法定質量標準予以評價和判定［19］。美國更是在其獸醫局規章中規定了進行滅活獸用生物制品相關抗原含量測定的所有體外效力檢驗，均應采用有效期內的參考免疫原制備物來進行平行測定或其他能夠證明在平行關系、特異性和重復性方面至少與平行測定等同的其他方法進行［20］。當然，ELISA并不是唯一適用滅活苗抗原定量的檢驗方法，如對口蹄疫滅活疫苗，我國農業部已于2014年初制定并發布了口蹄疫滅活疫苗內毒素和總蛋白測定法及相應標準，利用不同方法對疫苗進行破乳取得水相，測定其中內毒素含量，并采用Lowry法測定其總蛋白含量［21］。并且農業部發布了《關于做好口蹄疫疫苗質量標準提升工作的通知》，在提高口蹄疫滅活苗及合成肽苗的質量標準的同時，要求相關生產企業結合自身實際，盡快組織企業生產和質量檢驗人員，認真學習、準確理解新增檢測參數，掌握檢驗技術［22］。該方法將逐步取代以牛為實驗動物的PD50測定法，在節約成本、提高效率的同時，有利于國家對口蹄疫疫苗的監督管理，進而大大促進口蹄疫防控工作的開展。

在疫苗的抗原定量法檢驗疫苗效力的研究中，熒光定量PCR方法也受到了許多研究人員的關注。熒光定量PCR方法可對抗原的核酸特定片段進行快速定量檢測，具有實時性、高靈敏度、高通量檢測、高特異性等優點，并能夠以核酸拷貝數的形式具體、準確、客觀地顯示抗原的含量。Marsha S Russell等利用熒光定量PCR方法評價了水痘弱毒活疫苗的效力，并與傳統的蝕斑計數檢驗法進行了相關性分析，證明了兩者之間沒有顯著差異，具有良好的相關性［23］。陳鍇等也探索了利用熒光定量PCR方法作為豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗替代方法的可行性［24］。然而，該方法測得的病毒核酸載量不能直接反映其中正確組裝的病毒粒子數量［20］，且無法區分病毒是否具有活性［25］，這些弱點限制了熒光定量PCR方法作為效力檢驗替代方法的應用。如何正確應用該方法測定疫苗的效力，還有待進一步研究。

3 結語

應用動物試驗替代方法進行獸用疫苗檢驗已是許多研究人員的共識，是疫苗檢驗工作的必然發展趨勢。但我國的動物試驗替代方法研究相比國外發展緩慢，在獸用疫苗檢驗替代方法尤其是體外抗原測定法及參考品的研制和應用上相對滯后，不但一些已有的疫苗產品仍在使用傳統方法檢驗，一些新研制的疫苗產品也是如此。有些研究人員在探索替代方法時仍存在一些誤區，認為在檢驗疫苗效力時必須進行本動物攻毒試驗。其實，建立動物試驗替代方法的關鍵是要建立替代方法和傳統方法的平行關系，在不同批次產品間進行重復確認，并應用統計學方法對兩種方法的相關性進行分析，以保證實現兩種方法的等效替代，進而真正建立起應用替代方法檢驗疫苗效力的質量標準。這就需要相關研究人員在研發、申報新產品時，除了改善生產工藝，研發新型疫苗，應用新型佐劑以外，要轉變觀念，勇于探索替代方法并進行嚴格驗證；相關監督管理機構也可以通過建立新的指導原則和評價標準來對替代方法研究進行引導和鼓勵。動物試驗替代方法在疫苗檢驗中的普及，在節約檢驗成本、提高檢驗效率、保障動物福利的同時，也必將使疫苗的監督管理工作更細化、更及時，從而促進我國動物疫病防控工作的開展。

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［1］William M S Russell，Rex Burch.The principles of humane experimental technique［M］.London，Methuen，1959：238.

［2］賀爭鳴.我國動物實驗替代方法研究的思路、模式和優先支持研究領域［D］.北京：中國農業大學，2004.

［3］Smyth D.Alternatives to Animal experiments［M］.London：SeolarPress，1978：218.

［4］彭雙清.毒理學替代法［M］.北京：軍事醫學科學出版社，2009：5.

［5］張素慧，周志俊.國內外動物實驗替代方法發展概況與思考［J］.毒理學雜志，2013，27（5）：394－398.

［6］李繼平，賀爭鳴，李冠民，等.我國開展動物實驗替代方法工作的前景研究（一）——我國動物實驗替代方法研究的現狀［J］.中國實驗動物學雜志，2002，12（4）：236－238.

［7］賀爭鳴，李冠民，岳秉飛，等.我國動物實驗替代方法研究工作的現狀與發展［J］.實驗動物科學與管理，2003，20（增刊）：51－58.

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［10］劉小兵.加強動物實驗替代方法研究［N］.光明日報，2003－11－16.

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［12］陳光華.實驗動物與獸用生物制品檢驗和研發［J］.中國比較醫學雜志，2011，21（10）：20－23.

［13］中華人民共和國農業部公告第1448號.豬圓環病毒2型滅活苗（SH株）質量標準［Z］.

［14］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部［S］.

［15］趙 俊，李少英，武 華.口蹄疫滅活疫苗效力檢驗替代方法研究進展［J］.畜牧與獸醫，2011，43（5）：95－98.

［16］Hans Draayer.Overview of currently approved veterinary vaccine potency testing methods and methods in development that do not require animal use［J］.Procedia in Vaccinology，2011，5：171－174.

［17］中華人民共和國農業部公告第1392號.豬支原體肺炎滅活疫苗（P－5722－3株）質量標準［Z］.

［18］中華人民共和國農業部公告第1465號.豬圓環病毒2型桿狀病毒活載體滅活疫苗質量標準［Z］.

［19］United States Department of Agriculture Center for Veterinary Biologics Testing Protocol.SAM318.04.Supplemental assay method for estimating relative potency by the automated selection of line segments in RelPot 4.0 software［Z］.

［20］美國農業部獸醫服務局規章第800.92號.按照聯邦法規9CFR113.8對分發銷售的產品批進行體外檢驗［Z］.

［21］中華人民共和國農業部公告第2078號.口蹄疫滅活疫苗內毒素和總蛋白測定法［Z］.

［22］農業部辦公廳關于做好口蹄疫疫苗質量標準提升工作的通知［EB／OL］.（2013－06－13）.http：／／www.moa.gov.cn／zwllm／tzgg／tfw／201306／t20130613_3491208.htm.

［23］Marsha S Russell，Changgui Li，Louise Larocque，et al.Rapid and accurate determination of the potency of varicella vaccine by quantitive polymerase chain reaction［J］.Vaccine，2011，29：8490－8495.

［24］陳 鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價檢驗替代方法的研究與應用［J］.中國農業科學，2013，46（1）：162－169.

［25］魏 津，蔣 卉，戴志紅，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1－R株）病毒含量熒光定量PCR方法的建立［J］.中國獸醫雜志，2013，47（10）：39－42.

（編 輯：李文平）

Application of Alternatives to Animal Experiments in the Evaluation of Veterinary Vaccine

WANG Xiao－hui，LI Cui，JIANG Hui，ZHANG Xiu－ying，WEN Fang，LU Lian－shou，WANG Zai－shi?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

This review has introduced the alternatives to animal experiments and its development situation at home and abroad.Besides，this paper has provided an overview about the application，advantages and significance of alternatives to animal experiments from three aspects，including the improvement of animal use，the serological assay and the quantification of antigens in the vaccine，so as to offer benefit to the research of the alternatives to animal experiments in the evaluation of veterinary vaccine.

the alternatives to animal experiments；the evaluation of veterinary vaccine

2015－01－16

A

1002－1280（2015）04－0060－05

S859.79

948項目（2011－G14543）；“十二五”科技基礎性工作專項重點項目（2013FY113300－3）

王曉卉，碩士研究生，從事獸藥標準物質研究。

王在時。E－mail：wangzaishi＠ivdc.org.cn