甲病毒載體的研究進展

龔文芝，劉 燦，張東東，寧宜寶

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

甲病毒載體的研究進展

龔文芝，劉 燦，張東東，寧宜寶?

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

甲病毒屬于披膜病毒科，是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒。近些年來，國內外有關甲病毒載體的研究非常活躍，其已被用于疫苗研究、基因治療以及分子生物學等研究領域。基于甲病毒載體的構造原理，將其分為三類，分別為復制完全型載體、復制缺陷型載體和DNA／RNA載體。就這三類載體的改造過程進行了探討，并對這三類載體的特點及其應用研究進展等方面進行了闡述，以期為開發出更安全、更有效的甲病毒載體提供參考。

甲病毒；復制子載體；高水平表達

甲病毒（Alphavirus）屬于披膜病毒科（Togavirus family），是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒，該病毒寄主廣泛，由吸血昆蟲或節肢動物叮咬易感脊椎動物而傳播，目前已發現包括辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SINV）、塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus，SFV）、委內瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephalomyelitis virus，VEEV）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）等30個成員。甲病毒基因組5’末端的前2／3部分編碼非結構蛋白，稱為非結構區，該區共編碼4種非結蛋白（nsp1～nsp4），而靠近3’末端的后1／3稱為結構區，編碼數種結構蛋白，這些結構蛋白由亞基因組mRNA翻譯得到，其包括衣殼蛋白（C）、膜糖蛋白E1、E2、E3以及6 K蛋白等。甲病毒在感染細胞過程中5’末端2／3的基因組RNA首先翻譯，產生RNA復制和轉錄所需要的nsps，然后在nsps的作用下，啟動子P26S啟動亞基因組mRNA的轉錄，鑒于亞基因組mRNA的沉降系數為26S，因此該亞基因組的啟動子命名為P26S。隨后經過翻譯，在病毒和宿主編碼蛋白酶的聯合作用下裂解為衣殼蛋白和膜糖蛋白，這些結構蛋白與病毒基因組RNA裝配成核衣殼后以出芽方式釋放［1］。

基于甲病毒的這些生物特性和復制特點以及甲病毒cDNA感染性克隆的建立，人們衍生出一些甲病毒表達載體，目前對辛德畢斯病毒（SINV）、塞姆利基森林病毒（SFV）、委內瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）的載體研究最為廣泛。甲病毒載體主要分為三種：復制型載體、復制缺陷型載體和DNA／RNA載體，本文將分別對這三種載體的基本原理和特點以及其應用進行闡述，旨在為開發出更安全、更有效的甲病毒載體提供參考。

1 甲病毒載體的分類

1.1 復制完全型載體 甲病毒復制完全型載體系統一般由兩個載體構成：一個為表達載體，其包含病毒RNA復制所必需的非結構蛋白病毒基因；另一個為輔助載體，其包含重組病毒顆粒的結構基因，如衣殼、膜蛋白基因和6K蛋白基因等。

這類載體本質上是重組后的病毒，轉染宿主細胞后能產生子代病毒顆粒，能夠自我復制。通過對該載體進行特異的突變、基因敲除或在病毒序列中適當位置引入外源基因，用以研究和闡明甲病毒的生物特性和分子機理。人們發現RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）的出錯率影響病毒RNA在復制過程中的突變率，進而影響病毒的感染和傳播能力。Lark L Coffey等［2］在一株CHIKV的感染性克隆基礎之上，將其基因組RdRp所在的nsp4非結構蛋白區域的單個氨基酸C483Y進行突變，該突變有利于抵抗病毒突變誘導劑的作用，實驗發現該氨基酸突變的病毒突變體雖然在復制過程中確實保真性有所提高，但是在宿主蚊和新生小鼠體內與野生毒株相比感染能力、病毒滴度都有所下降。此外，如何控制復制完全型載體的復制與感染及其生物安全是用于疫苗研究亟需解決的關鍵性問題。

1.2 復制缺陷型載體 甲病毒復制缺陷型載體系統由兩個載體構成，一個表達載體包含病毒RNA復制所必需的非結構蛋白病毒基因（nsp1－4）和插在甲病毒強亞基因組26S啟動子之后的外源基因；另一個輔助載體只包含重組病毒顆粒的必需結構基因，如衣殼和膜蛋白基因等。

這類載體系統經共轉染入宿主細胞完成包裝之后能形成病毒顆粒，其不能自我復制但能感染宿主細胞，具有對宿主細胞的廣泛嗜性并進行短暫高效的轉基因表達，由于輔助載體缺乏該RNA包裝信號，在宿主細胞內組裝后的子代病毒不能自我增殖，導致重組的病毒顆粒表現為復制缺陷的特征，這種復制缺陷性載體又被稱之為“自殺性載體”。這類載體保留了甲病毒的諸多良好的生物特性如廣泛細胞嗜性、高水平表達等，表現為復制缺陷；然而該類載體雖然能夠產生較高外源基因的瞬時表達且免疫效果良好，但是其成本昂貴，而且在宿主細胞內由表達載體和輔助載體轉錄出的兩種RNA有可能發生重組從而產生完整的基因組導致病毒的傳播。為了解決這一問題，人們采取了多種策略對這種缺陷型載體進行改造，使該類載體具備了良好的生物安全性。Berglund等［3］在SFV的p62早期蛋白中E2與E3膜蛋白剪切位點附近進行三個位點進行點突變，將重組產生復制型病毒的可能性控制在較低水平。隨后，人們將輔助質粒的膜蛋白進行突變與單個輔助質粒拆分成多個輔助質粒的策略相結合，將這種重組可能性降到了極低的水平，理論上的重組概率只有4.2×10－17［4］。Kamrud等［5］發現通過缺失啟動子P26S的輔助質粒不僅不影響缺陷性病毒樣顆粒的產生，而且使重組產生復制完全型病毒的效率進一步降低。

1.3 DNA／RNA載體 DNA／RNA載體是以DNA為基礎的甲病毒載體，這類載體攜帶病毒復制酶基因，將亞基因組啟動子P26S之后的病毒結構蛋白由一段多克隆位點代替，并在該多克隆位點插入外源基因，隨后借用甲病毒的復制酶以及甲病毒亞基因組啟動子P26S的高效啟動子，大量轉錄并翻譯合成外源蛋白。

DNA／RNA載體在轉染之前必須首先進行體外轉錄，制備5’末端含有帽子結構和3’末端含有PolyA尾的重組RNA；但是這種方法操作繁瑣，產生的轉錄物容易降解。將真核表達元件如真核啟動子、轉錄終止區等構建入甲病毒重組質粒可以有效解決這一問題。Kohno等［6］用人巨細胞病毒（CMV）早期啟動子取代SFV載體原SP6啟動子，并引入多聚腺苷酸尾；這種經過改造后的甲病毒載體避免了體外制備RNA繁瑣的過程，并且以DNA的形式直接轉染入動物細胞進行外源蛋白的表達。Chen等［7］將質粒pSFV1的啟動子替換成人端粒酶逆轉錄酶啟動子并且引入SV40poly（A）多聚腺苷酸尾，將改造好的質粒電轉入沙門氏菌弱毒株SL7207，而該弱毒株類似“運載工具”能使質粒進入腫瘤細胞；體內外實驗表明該靶向性的甲病毒復制子pShT－ePNP能夠在腫瘤細胞內高效表達外源基因。這類載體一般在12 kb左右，筆者將構建帶有EGFP熒光蛋白的該類載體采用不同公司的轉染試劑進行轉染，結果發現各種試劑轉染效率都不高，正是由于較大的相對分子質量使得這類載體轉染效率不高并且轉染方法或試劑也會帶來一些負面效果如間接抑制病毒復制、激活抗病毒細胞反應等等，由此運用新型的轉染試劑或方法顯得極為迫切。有研究發現一些短肽如細胞透膜肽（Cellpenetrating peptides，CPPs）可以作為有效載體以無毒副作用的方式來運輸核酸透過細胞膜［8－9］。DNA／RNA載體由于不能產生病毒顆粒，喪失了對宿主細胞的廣泛嗜性，也還能誘導宿主細胞快速凋亡，進一步影響外源蛋白的釋放與折疊，從而可能會影響到免疫效果。

2 甲病毒載體的特點

2.1 高水平表達 甲病毒載體產生的重組RNA復制子在其導入細胞內之后能高水平復制，如基于SFV復制缺陷型載體產生的重組RNA在每個細胞內大概有2×105個拷貝。甲病毒載體對外源基因的表達性能比非復制子載體要高。任曉慧等［10］將表達生長激素釋放激素（GHRH）的復制子載體pCMV－Rep－GHRH、普通載體 pIRES－GHRH和pCDNA3－GHRH轉染293細胞，將這三種不同載體分別轉染細胞，利用放射性免疫法（Radioimmunoassay，RIA）和RT－PCR對表達的GHRH進行定量分析，結果表明復制子載體表達外源基因的效率比非復制子載體高2～3倍。

2.2 增強免疫原性 甲病毒載體導入細胞之后，在細胞質中能夠大量合成出正、負鏈RNA，從而形成大量的雙鏈RNA復制中間體，其能夠激活非p53依賴性的雙鏈RNA依賴的蛋白激酶PKR和活化RnaseL導致細胞凋亡。細胞凋亡產生的凋亡小體能夠被表面具有ανβ5受體的樹突狀細胞（DCs）以及其他一些抗原呈遞細胞的攝取，提呈給CD8＋T細胞，可激發強而有力的細胞免疫［11］。甲病毒載體可誘導產生I型IFN，從而為表達抗原起到提供佐劑的效果。Leither等［12］用SIN DNA載體與普通載體分別在正常與敲除IFN－α／β受體的小鼠體內表達黑色素瘤抗原，實驗發現該載體與普通載體在敲除IFN－α／β受體的小鼠體內都不能產生激活IFN－α／β途徑的反應，而在正常小鼠體內，SIN載體能產生比普通載體更強的細胞免疫反應。Andrei Nikonov等［13］發現甲病毒的病毒復制酶只有在具有完整的RdRp活性時才能夠誘導產生IFN－β，在甲病毒感染宿主細胞后，其病毒復制酶可以對病毒RNAs和細胞RNAs進行修飾，激活RNA解旋酶RIG－1和MDA5等分子，從而介導I型IFN基因的轉錄。

3 甲病毒載體在疾病防治和生物制藥方面的應用

3.1 疫苗研究 復制完全型載體會引起生物安全方面的問題，由于插入外源基因導致其基因組大于野生型基因組從而容易呈現不穩定性，因此目前其主要用于甲病毒分機子機理方面的研究。復制缺陷型甲病毒載體，尤其是塞姆利基病毒和辛德畢斯病毒缺陷型以及近幾年來出現的VEEV－SINV嵌合體，正變成快速和高水平的基因表達的工具。甲病毒復制缺陷型表達系統也已經被用來作為治療與預防包括 HIV、Hendra和 Nipah許多病毒性疾病［14－15］。Vander Veen等［16］將豬流感病毒血凝素HA基因構建入復制缺陷型VEEV載體系統中，分別免疫實驗動物小鼠和豬，實驗證明高劑量的該疫苗免疫動物之后不但沒有引起VEEV的散播，而且免疫之后沒有出現毒力返強的現象，在免疫宿主豬時能夠產生很強的體液反應、IFN－γ免疫反應和能夠抵抗同源豬流感強毒的攻擊。也有研究者將VEEV空殼粒子作為滅活流感病毒疫苗的佐劑分子，動物實驗表明該空殼粒子能夠明顯提高滅活疫苗的免疫保護作用［17］。DNA／RNA載體在疫苗應用方面也很廣泛。Cheng等［18］將兔出血熱病病毒的VP60基因構建入，通過轉染實驗證實VP60基因得到表達，免疫兔實驗表明該復制子疫苗能夠誘導產生特異性的抗體和介導較強的細胞免疫反應，而且對致死毒量的攻擊達到全保護。筆者將佐劑蛋白GP96N端（26AA－374AA）基因與豬瘟病毒囊膜蛋白E2基因用linker串聯之后構建入塞姆利基森林病毒復制子pSCA1中，探討佐劑分子能否進一步提高免疫效果，目前對該構建完成的質粒進行免疫原性的研究中。Sun等［19］將SFV復制子元件和豬瘟病毒囊膜蛋白E2基因構建入腺病毒骨架內構成新的嵌合載體疫苗，動物實驗表明該疫苗解決了單純采用甲病毒復制子疫苗和腺病毒疫苗免疫保護不完全的問題，具備良好的免疫原性，同時為新的疫苗設計提供了思路。

3.2 癌癥研究 甲病毒載體在抗癌癥研究中具有重大的潛力。甲病毒載體可以用來表達腫瘤抗原或者抗腫瘤蛋白，能殺死癌癥細胞，而且甲病毒載體也能增強抗原表達和激發細胞凋亡機制［26］。采用甲病毒載體表達一些細胞因子如IL－12、IL－18、GM－CSF或者腫瘤相關抗原（Tumor associated antigens，TAAs）來作為疫苗已經成功運用到腫瘤動物模型；而且SINV具有對腫瘤細胞的自然嗜性，能夠專性誘導腫瘤細胞凋亡［20－23］。 Tseng等［24］將自殺式基因hsvtk構建入SINV復制完全型載體的nsp3中，結果表明在前藥苷昔洛韋的存在下，該載體能誘導腫瘤細胞凋亡，其一方面抑制辛德畢斯病毒在細胞內的增殖，另一方面有助于前藥激活之后產生的毒力代謝產物擴散到周圍未感染的腫瘤細胞，進一步增強對腫瘤細胞的殺傷作用。此外，基于VEEV的復制缺陷型載體疫苗治療前列腺癌已進入I期臨床實驗［25］。

3.3 外源蛋白表達 哺乳動物細胞源的醫用和獸用生物藥品的數量與日俱增，而在生物制藥方面，人們普遍認為生產外源蛋白有兩種策略：采用穩定的細胞系和基因的短暫表達。市場上的這類生物藥品全部來自與穩定的重組細胞系，由于瞬時基因表達過程能夠在短時間內產生高水平的蛋白表達而成為研究的熱點，而且病毒性的載體已經被大量運用于表達重組蛋白，其中復制缺陷型的塞姆利基病毒載體和辛德畢斯病毒載體由于良好的生物安全性、細胞的廣泛嗜性和快速高水平的基因表達能力受到廣泛青睞。許多不同的重組蛋白也已經在甲病毒載體中得到表達，這些重組蛋白包括功能性的膜蛋白、受體、酶以及病毒蛋白。修飾后的SFV載體在哺乳動物細胞內表達G蛋白偶聯受體，能夠達到10 mg／L和100～300 pmol／mg的總蛋白，相比穩定的細胞系和其他瞬時轉染載體，采用塞姆利基病毒載體表達的產量是穩定的細胞系和其他瞬時轉染載體的20多倍［26－27］。然而，這些表達的蛋白也還僅限于實驗水平，需要進一步優化條件才能進行規模化生產，如降低病毒生產的費用，合適的生物反應器和感染病毒粒子之后的培育措施以及病毒粒子的定量方法等［28］。

4 展望

三類甲病毒載體都具有區別其他病毒或非病毒性載體的獨特優勢而且也各具千秋。目前，甲病毒載體已經在甲病毒分子機理、抗癌癥研究和治療許多病毒性疾病方面得到了廣泛的應用，但是其潛力還沒有得到充分的挖掘。開發可控型、具有靶向治療效果的甲病毒載體和建立能夠提高該類載體瞬時外源蛋白表達量的細胞系以及探究該類載體的臨床實驗效果等都是今后努力的方向。相信隨著對甲病毒載體研究的不斷深入，該類載體在有效性和安全性方面將進一步提高，從而為未來對抗疾病提供有力的生物學工具。

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（編 輯：李文平）

Review on Alphavirus－based Vectors

GONG Wen－zhi，LIU Can，ZHANG Dong－dong，NING Yi－bao?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

Alphaviruses belong to the family ofTogaviridae，which are encapsulated by a capsid protein and possess single strand plus RNA.In recent years，the domestic and foreign research on alphavirus－based vectors is active and the alphavirus－based vectors have been used for vaccine research，gene therapy and molecular biology research.Based on the structural principle，the alphavirus vectors are classified into three main types：replicationcompetent vector，replication－deficient vectors and DNA－layered vector.In this review，the transformation，characteristics and application of three different alphavirus－based vectors are discussed in order to provide references for the development of safer，more effective alphavirus－based vectors.

alphaviruses；replicon－based vectors；high－level expression

2014－12－03

A

1002－1280（2015）04－0065－05

S852.65＋9.6

龔文芝，碩士研究生，從事獸用疫苗研發工作。

寧宜寶。E－mail：ningyibao＠ivdc.org.cn