植物代謝組學(xué)及其在煙草上的應(yīng)用進(jìn)展

張麗，姬厚偉，黃錫娟，王芳，劉劍

貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心, 貴陽(yáng)市小河區(qū)開發(fā)大道96號(hào) 550009

植物代謝組學(xué)及其在煙草上的應(yīng)用進(jìn)展

張麗，姬厚偉，黃錫娟，王芳，劉劍

貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心, 貴陽(yáng)市小河區(qū)開發(fā)大道96號(hào) 550009

作為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要分支，代謝組學(xué)是一門研究生物體系受內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)后（基因的改變或環(huán)境的變化），其產(chǎn)生的小分子代謝物變化的科學(xué)。代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于天然藥物開發(fā)、植物學(xué)、微生物學(xué)和食品安全等研究領(lǐng)域。本文對(duì)代謝組學(xué)的形成與發(fā)展、植物代謝組學(xué)研究方法及其在煙草中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對(duì)植物代謝組學(xué)的發(fā)展及其在煙草中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。認(rèn)為代謝組學(xué)將在煙草基因功能解析、揭示代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)理和提高煙草品質(zhì)等生物技術(shù)應(yīng)用方面發(fā)揮不可替代的作用。

植物代謝組學(xué)；煙草；應(yīng)用

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新的分支，其以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)[1]。通過(guò)分析特定生理時(shí)期內(nèi)新鮮組織樣品中的糖類、脂類、氨基酸、核苷酸等所有小分子代謝物（分子量小于1000）的變化，代謝組學(xué)可從全局表征生物體在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)（基因的改變或環(huán)境的變化）后其代謝產(chǎn)物的變化[2]。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的不斷發(fā)展完善及數(shù)據(jù)處理方法的不斷優(yōu)化創(chuàng)新，代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于天然藥物開發(fā)、植物學(xué)、微生物學(xué)和食品安全等諸多研究領(lǐng)域[3]。本文綜述了代謝組學(xué)的形成與發(fā)展、研究方法及其在煙草上的應(yīng)用。

1 代謝組學(xué)的形成與發(fā)展

代謝組學(xué)相關(guān)研究可追溯到上世紀(jì)70年代的代謝譜分析（metabolic pro fi ling），通常采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography mass spectroscopy，GC-MS）對(duì)患者體液中代謝物進(jìn)行定性、定量分析，進(jìn)而對(duì)疾病進(jìn)行診斷和分析[4]。1983年，荷蘭應(yīng)用科學(xué)研究組織Van der Greef[5]首次采用質(zhì)譜研究了尿中代謝指紋，隨后高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)被應(yīng)用于代謝譜分析。1997年，Oliver[6]提出通過(guò)定量分析盡可能多的代謝產(chǎn)物來(lái)評(píng)估酵母基因的遺傳功能及其冗余度，首次將代謝產(chǎn)物和生物基因的功能聯(lián)系起來(lái)。1999年，Nicholson等[7]提出metabonomics的概念，將其定義為生物體對(duì)病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生的代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)應(yīng)答的定量測(cè)定。2000年，德國(guó)馬普所的Fiehn等[1]提出了metabolomics的概念，將其定義為對(duì)限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產(chǎn)物的定性定量分析。

植物代謝組學(xué)始于20世紀(jì)90年代初，Sauter等[8]首次將代謝組分析引入植物系統(tǒng)診斷，最具代表性的是Fiehn等[2]在擬南芥方面的研究工作。植物中代謝物超過(guò)20萬(wàn)種，有維持植物生命活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育所必需的初生代謝物以及利用初生代謝物生成的與植物抗病和抗逆關(guān)系密切的次生代謝物等，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育都有重要作用。根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同，將代謝組學(xué)分為四個(gè)層次，即：代謝物靶標(biāo)分析（target analysis）、代謝輪廓（譜）分析（metabolite pro fi ling）、代謝組學(xué)（metabolomics）和代謝指紋分析（metabolic fi ngerprinting），其中代謝物靶標(biāo)分析為靶向分析方法，而其余三個(gè)層次均為非靶向分析方法。非靶向的代謝譜分析和代謝物靶標(biāo)分析是植物代謝組學(xué)近年研究的熱點(diǎn)[9]。

2 代謝組學(xué)研究方法

代謝組學(xué)是一門交叉學(xué)科，涉及生物科學(xué)、分析化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和信息學(xué)。其主要流程包括樣品制備、代謝物的分離和檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析及模型的建立等[10]。由于植物中代謝物的種類繁多，結(jié)構(gòu)迥異，且分析手段和數(shù)據(jù)分析方法又多種多樣。根據(jù)研究對(duì)象不同，采用的樣品制備、分離鑒定手段及數(shù)據(jù)分析方法也各不相同。

2.1 樣品制備

植物代謝組學(xué)樣品制備主要包括樣品采集、干燥、提取和樣品預(yù)處理等步驟。采樣是最重要的步驟之一，是最為重要的實(shí)驗(yàn)誤差來(lái)源。為使采樣差異最小化，必須嚴(yán)格控制植物的生長(zhǎng)狀態(tài)、優(yōu)化采樣方法、采樣時(shí)間、采樣面積和數(shù)量等。為真實(shí)反映植株體內(nèi)的真實(shí)信息，須立即阻斷內(nèi)在酶的活性，通常采用冰凍/液氮降溫法保存樣品。另外，在提取代謝物之前，需除去樣本材料的水分子，冷凍干燥是最常用的技術(shù)。與其他加熱蒸發(fā)技術(shù)相比，該方法條件相對(duì)溫和，在低溫條件下，酶活性被抑制，可減少酶催化氧化和降解，從而避免樣品氧化等活化因素引起的成分變化[11]。

代謝物的提取在樣品制備過(guò)程中尤為重要，其直接影響代謝譜的范圍。植物代謝物提取要盡量快速，以避免（至少減少）萃取過(guò)程中代謝物的降解和修飾。目前，代謝物提取最普遍的方法是先將植物組織均一化（用研缽研磨或球磨機(jī)或機(jī)械裝置）[12]，然后在高溫或低溫下振蕩、超聲或渦流（內(nèi)含玻璃珠）萃取[13-14]。萃取溶劑一般為單一有機(jī)溶劑或混合溶劑，對(duì)于極性代謝物，通常使用甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈或水以及不同比例的混合溶劑，而對(duì)于更多的親脂性化合物，常用氯仿來(lái)萃取[15]。對(duì)于混合溶劑，甲醇、水和氯仿的混合溶劑最常用，3:1:1的比例可避免溶劑分相[16]。2004年，Gullberg等[16]進(jìn)行DOE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了萃取和衍生條件對(duì)擬南芥GC-MS代謝組學(xué)研究的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明先用200 μL的氯仿萃取，然后加800 μL 3:1的甲醇-水形成單一相的萃取效果最好。2011年，Li等[17]用GC-MS對(duì)煙葉進(jìn)行代謝輪廓分析，對(duì)萃取溶劑（甲醇、水、乙腈、氯仿）種類、比例進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明水、甲醇和乙腈體積比為3:1:1時(shí)對(duì)大多數(shù)煙草成分萃取效果最好。同年，Li等[18]還對(duì)LC-MS/MS分析煙草中代謝物的前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明用水提取親水性成分，用己烷提取親脂性成分的效果最好。揮發(fā)性成分（VOCs）是植物代謝組中的一類關(guān)鍵致香成分，其常用的萃取方法主要有溶劑萃取、靜態(tài)頂空、動(dòng)態(tài)頂空[19]和頂空固相微萃取（SPME）[20]。2012年，Ma等[21]建立了一種基于SPME-GC-MS的煙草非靶向代謝譜分析方法。2014年，張麗等[22]建立了一種分析卷煙煙絲中嗅香成分的吹掃捕集-GC-MS法，該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)卷煙煙絲中170種嗅香成分的同時(shí)、快速分析，且具有操作簡(jiǎn)單、樣品提取非破壞性、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

大多數(shù)初級(jí)代謝物（如有機(jī)酸、糖、氨基酸和類固醇等）是非揮發(fā)性的，不適合直接進(jìn)行GC-MS分析，因此GC-MS分析前通常需要對(duì)代謝物進(jìn)行衍生化處理。對(duì)含-OH、-SH、或-NH功能基團(tuán)的極性化合物常用的衍生化方法是使其三甲基硅烷化（TMS）[3]。而還原糖在溶液中存在不同的異構(gòu)體，單糖的TMS衍生物會(huì)形成多重峰，因此在TMS衍生化之前需用羥基胺或烷基羥胺將醛和酮肟化（防止葡萄糖成環(huán)），從而減少異構(gòu)體的數(shù)目。

2.2 代謝物的分離和檢測(cè)

代謝組學(xué)分析對(duì)象種類繁多，濃度范圍分布廣，性質(zhì)差異大，要對(duì)它們進(jìn)行無(wú)偏向的全面分析，單靠一種分離分析手段難以完成，因此色譜、質(zhì)譜、核磁共振、紅外光譜、庫(kù)侖分析、紫外吸收、熒光散射、發(fā)射性檢測(cè)和光散射等分離分析手段及其組合都被應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究[9]。一般根據(jù)樣品的特性和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模蛇x擇最合適的分析方法，目前最常用的分離分析手段是NMR和MS技術(shù)。

2.2.1 核磁共振（NMR）

NMR是一種基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場(chǎng)作用下吸收射頻輻射而產(chǎn)生能躍遷的譜學(xué)技術(shù)，是最早被用于代謝組學(xué)研究的技術(shù)之一。目前常用的有氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）和磷譜（31P-NMR），其中以1H-NMR應(yīng)用最為廣泛[23]。NMR為非侵入性分析，可對(duì)粗提取液、細(xì)胞懸濁液、完整的組織或整個(gè)器官中的代謝物進(jìn)行分析，是現(xiàn)有代謝組學(xué)分析技術(shù)中唯一能用于活體和原位研究的技術(shù)。特別是最近開發(fā)的魔角旋轉(zhuǎn)（Magic angle spinning，MAS）、磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）和活體磁共波譜（Vivo magnetic resonance spectroscopy，MRS）等技術(shù)能夠無(wú)創(chuàng)、整體、快速地獲得機(jī)體某一指定活體部位的NMR譜。2010年，Pérez等應(yīng)用高分辨MAS-1H-NMR譜對(duì)番茄果實(shí)及其組織進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)番茄不同組織（果皮、果肉和種子）以及不同成熟度的番茄（綠色、轉(zhuǎn)變期、紅色）代謝譜進(jìn)行了區(qū)分。該方法不僅極大程度地減少了樣品處理過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)極性和非極性化合物的同時(shí)分析，且可獲得與1H-NMR譜相似的分辨率[24]。當(dāng)采用漫射編輯（Diffusion-Editing）技術(shù)時(shí)，NMR方法還能提供豐富的分子信息，如代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、濃度、分子動(dòng)力學(xué)及相互作用等[25]。另外，每個(gè)化合物的NMR譜圖是唯一的、特定的，且信號(hào)強(qiáng)度與分析物濃度直接成正比，故NMR可以同時(shí)提供定性和定量信息。NMR分析的好壞直接取決于定性的信號(hào)數(shù)目，因此植物代謝物NMR譜庫(kù)的建立和完善將推動(dòng)NMR技術(shù)在代謝組學(xué)中的廣泛應(yīng)用[26]。

NMR技術(shù)最大的不足在于靈敏度低，有可能形成信號(hào)重疊。為了提高其靈敏度、選擇性和譜圖的分辨率，二維NMR常被使用。相關(guān)譜（correlated spectroscopy，COSY）、 異 核 多 量 子相 干 譜（heteronuclear multiple quantum coherence，HMQC）、異核多量子相關(guān)譜（heteronuclear multiple bond correlation， HMBC）可提供不同核間的相關(guān)關(guān)系信息，從而可提高代謝物定性能力[27]。此外，隨著更高強(qiáng)度的磁場(chǎng)（900 MHz）、低溫冷卻探針和小容量微探針（60 μL）等技術(shù)的引入，很大程度上彌補(bǔ)了其靈敏度不高、分辨率低的劣勢(shì)[28-29]。

2.2.2 質(zhì)譜技術(shù)（MS）

與NMR相比，MS具有高選擇性和靈敏度、普適性和分析速度快等特點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)、鑒定多種代謝物，提供豐富的數(shù)據(jù)信息等優(yōu)點(diǎn)，已成為代謝組學(xué)研究最為有效的手段之一[30]。質(zhì)譜技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用主要有直接進(jìn)樣和色譜質(zhì)譜聯(lián)用兩種方式。直接進(jìn)樣質(zhì)譜方法分析速度快，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量樣本的快速篩選，常用于代謝指紋分析。近年來(lái)，飛行時(shí)間質(zhì)譜（Time of fl ight-mass spectroscopy，TOFMS）、傅立葉變換-離子回旋共振-質(zhì)譜（Fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR-MS）、軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap）等高分辨質(zhì)譜儀可通過(guò)精確質(zhì)量定性未知化合物，進(jìn)一步擴(kuò)展了直接進(jìn)樣質(zhì)譜技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用[31]。2008年，Giavalisco等[32]利用FT-ICR-MS直接進(jìn)樣方法在擬南芥地上部分鑒定出1000多種化學(xué)成分，其中80%的成分未在擬南芥中報(bào)道過(guò)。解析電噴霧離子化（Desorption electrospray ionization，DESI）、 實(shí)時(shí)直接分析（Direct analysis in real time，DART）、電噴霧萃取電離（Extractive electrospray ionization，EESI）等新的離子化技術(shù)的發(fā)展也促進(jìn)了直接進(jìn)樣質(zhì)譜在代謝組學(xué)中的應(yīng)用[33]。但這些設(shè)備都比較昂貴，限制了其在代謝組學(xué)中的普遍使用。另外，直接進(jìn)樣質(zhì)譜方法還存在著共抑制效應(yīng)、離子化效率低、無(wú)法區(qū)分加合物與產(chǎn)物離子及異構(gòu)體等缺點(diǎn)。為了避免這些問(wèn)題，同時(shí)降低樣品基質(zhì)的干擾，近年來(lái)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用較為廣泛，如GC-MS、LC-MS或毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（Capillary electrophoresis，CE-MS）[34-35]。

GC-MS具有分離效率高，重現(xiàn)性好，有可利用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)[36]，易于使用且相對(duì)較為經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，且可同時(shí)測(cè)定幾百種化學(xué)性質(zhì)不同的代謝物，包含了糖酵解、三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝等代謝通路中的重要代謝物，如糖、氨基酸、有機(jī)酸、生物堿、萜類、甾體等[37]。2000年，F(xiàn)iehn等[1]采用GC-MS對(duì)不同基因型的擬南芥進(jìn)行了代謝譜分析，并對(duì)擬南芥葉子提取液中的326種化合物進(jìn)行了定量，其中一半的化合物被定性。此后，GC-MS被廣泛應(yīng)用于模式植物（擬南芥、水稻等）[1,38]、部分經(jīng)濟(jì)作物（馬鈴薯塊莖、西紅柿等）[39-40]以及一些藥用植物（青蒿、黃芪等）[41-42]的非靶向代謝組學(xué)研究中。而在對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行分析時(shí)，由于一維色譜峰容量的限制，很難達(dá)到理想的分離效果，全二維氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC×GC-MS）技術(shù)的使用則進(jìn)一步提高了色譜的分離效率，擴(kuò)大了峰容量，從而增加了代謝譜范圍[43]。因而GC×GCMS技術(shù)將會(huì)在代謝組學(xué)研究中復(fù)雜混合物的分離分析方面發(fā)揮更大的作用。

HPLC具有分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，與GC相比不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性影響，與MS聯(lián)用時(shí)，能夠集HPLC高分離性能和MS高靈敏度、高專屬性的優(yōu)點(diǎn)于一體，且具有提純和制備單一物質(zhì)的能力，而且前處理簡(jiǎn)單，可以避免衍生化等繁雜的預(yù)處理，因而LC-MS技術(shù)已發(fā)展成為代謝組學(xué)研究的主流分析手段[44]。用于代謝組學(xué)研究的LC-MS方法多集中在反相液相色譜（reversed-phase liquid chromatography，RPLC），但是傳統(tǒng)反相色譜柱存在對(duì)強(qiáng)極性的化合物無(wú)法保留，從而導(dǎo)致強(qiáng)極性樣品的信息損失。親水相互作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）技術(shù)是一種以極性固定相（如硅膠或衍生硅膠）及含高濃度極性有機(jī)溶劑和低濃度水溶液為流動(dòng)相的色譜模式，特別適用于強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性小分子物質(zhì)的分離。HILIC對(duì)復(fù)雜樣品中的極性物質(zhì)具有很好的靈敏度和選擇性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中[45]。2002年，Tolstikov等[46]利用HILIC-MS法測(cè)定了筍瓜葉柄韌皮部滲出液中的寡糖、糖苷、氨基糖、氨基酸和糖核苷酸，該方法前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高。一維液相色譜-質(zhì)譜應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品的代謝組學(xué)研究中同樣存在無(wú)法提供足夠的峰容量的不足，而全二維液相色譜（LC×LC）可將分離基質(zhì)不同的二維色譜柱（反相柱、親水柱、離子交換柱、親和色譜柱等）組合構(gòu)成分離系統(tǒng)，從而提高分離效果[47]。除了多維色譜外，也可采用超高效液相色譜（UPLC）改善極端復(fù)雜樣品的分離狀況。UPLC相對(duì)于HPLC更高效、快速、靈敏，和質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)基質(zhì)干擾減少，從而可提高質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度[48]。2011年，Creek等[49]針對(duì)LC定性難的問(wèn)題，建立了一種保留時(shí)間預(yù)測(cè)模型，提高了親水作用色譜-高分辨質(zhì)譜的代謝物鑒定能力。還有一些新型色譜如微流體色譜（micro fl uidics）和超臨界流體色譜（Supercritical fl uid chromatography，SFC）以其強(qiáng)大的分辨能力，在代謝組學(xué)研究中被發(fā)展和應(yīng)用[50,51]。

與GC、LC相比，CE具有儀器簡(jiǎn)單、分離效率高、分析速度快、溶劑消耗少、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[52]。CE-MS聯(lián)用提高了檢測(cè)靈敏度，在一次分析中可同時(shí)得到遷移時(shí)間、Mr和碎片特征信息，主要適用于分析極性和離子代謝物（如磷酸化化合物、核苷、核苷酸、TCA循環(huán)和鳥氨酸循環(huán)代謝物等），還可以區(qū)分結(jié)構(gòu)高度相似代謝物和同分異構(gòu)體化合物（如檸檬酸和異檸檬酸）。由于其分離機(jī)理和色譜不同，在生物樣品代謝組學(xué)研究中常作為GC、LC的補(bǔ)充[53]。2008年，Watanabe等[54]采用CE-ESI-TOF-MS對(duì)擬南芥插入T-DNA敲除突變體進(jìn)行了非靶向代謝譜分析，結(jié)果表明，γ-谷酰基-β-氰基-丙氨酸在Bsas的一個(gè)突變體（bsas3；1）中降低，而（Bsas3；1）與β-氰基-丙氨酸和γ-谷酰基-β-氰基-丙氨酸的合成有關(guān)。Sato等[55]用CE-MS 和CE-DAD（ 二極管陣列檢測(cè)器）分析水稻葉子中56種堿性代謝物的動(dòng)態(tài)變化，為認(rèn)知生物系統(tǒng)組成的復(fù)雜相互關(guān)系提供了依據(jù)。Sawalha等[56]用CE-MS/MS通過(guò)對(duì)甜味和苦味橘皮提取物中的黃酮類代謝物定性和定量分析，為獲取天然黃酮提供了新途徑。Levandi等[57]用CE-MS研究發(fā)現(xiàn)3種轉(zhuǎn)基因玉米和普通玉米之間存在一些明顯差異的代謝物。

2.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

通過(guò)儀器分析得到的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)是一個(gè)龐大的、多維矩陣，需將其轉(zhuǎn)化為適合多變量分析的數(shù)據(jù)形式，方可用化學(xué)計(jì)量分析對(duì)不同數(shù)據(jù)加以整合后從中有效挖掘出所需信息。目前數(shù)據(jù)分析常用的主要手段為模式識(shí)別技術(shù)，包括無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法[11]。

2.3.1 無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法

無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法主要是采用原始圖譜信息或者預(yù)處理后的信息對(duì)樣本進(jìn)行分類。該方法將獲得的分類信息與樣本的原始信息進(jìn)行比較，建立代謝產(chǎn)物與原始信息的聯(lián)系，從而篩選出與原始信息相關(guān)的標(biāo)記物，進(jìn)而考察其中的代謝途徑。無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法中應(yīng)用最廣泛的是主成分分析（PCA）、聚類分析（HCA）、非線性映射（NLM）、自組織投影（SOM）和K近鄰法（KNN）等。其中，PCA和HCA在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理中較常用[58]。

PCA是將分散的數(shù)據(jù)信息整合集中到幾個(gè)主成分上，進(jìn)而通過(guò)主成分來(lái)描述生物集體的代謝變化情況。在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理中，PCA是最早且使用最廣泛的多變量模式識(shí)別方式之一，其具有不損失樣品信息、對(duì)原始數(shù)據(jù)降維的同時(shí)避免原始數(shù)據(jù)的共線性問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)。得分圖（score plot）將樣本的分類信息給以直觀的表示，載荷圖（loading plot）則給出對(duì)分類有貢獻(xiàn)的變量及其貢獻(xiàn)的大小。

2.3.2 有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法

有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法主要是建立樣本間的數(shù)學(xué)模型，使各類樣本間達(dá)到最大的分離，然后利用建立的多參數(shù)模型對(duì)未知樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。這類方法在建立模型時(shí)有可供學(xué)習(xí)的訓(xùn)練樣本，故稱為有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法。除了需要建立用來(lái)確認(rèn)樣品類別的確認(rèn)集（validation set），還需要建立用來(lái)測(cè)試模型性能的測(cè)試集（test set）。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法主要包括傳統(tǒng)的判別分析（DA）、偏最小二乘法（PLS）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）等[59,60]。

PLS-DA是代謝組學(xué)中最常用的有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，它可有效的克服自變量的多重相關(guān)性，對(duì)較少的樣本進(jìn)行建模和有效的篩選。與PCA相比，PLS計(jì)算得到的擬合殘差最小，穩(wěn)定性最高，改善各變量的作用方向使其更符合專業(yè)解釋。PLS-DA主要通過(guò)載荷圖和變量重要性指數(shù)（VIP）給出對(duì)分類起重要作用的差異代謝物。然而近年來(lái)，正交信號(hào)校正（OSC）被用于PLS的數(shù)據(jù)過(guò)濾，通過(guò)過(guò)濾掉與類別判斷正交（無(wú)關(guān)）的變量信息，只包含與類別判斷相關(guān)的變量，從而提高判別的準(zhǔn)確性[61]。此外，還有支持向量機(jī)（Support vector machine，SVM）方法已逐漸應(yīng)用于代謝組學(xué)后期數(shù)據(jù)的判別分析中，其預(yù)測(cè)精度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的PLS-DA方法[62]。

3 植物代謝組學(xué)在煙草中的應(yīng)用

代謝物是細(xì)胞調(diào)控的最終產(chǎn)物，代謝物種類和含量可認(rèn)為是生物系統(tǒng)對(duì)基因或環(huán)境改變的最終響應(yīng)[2]。代謝物離生物的表現(xiàn)型或生理狀態(tài)最近，更能夠揭示基因、環(huán)境和表現(xiàn)型之間的關(guān)系。煙草品質(zhì)（香味與有害物質(zhì)）及抗性性狀受多因素調(diào)控，僅對(duì)單個(gè)基因或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究無(wú)法闡明這些性狀的生理學(xué)或生物化學(xué)基礎(chǔ)，而利用代謝組學(xué)手段，研究不同香味風(fēng)格煙草品質(zhì)及抗性形成過(guò)程各關(guān)鍵階段（如煙草的打頂及成熟期）代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，將能揭示煙草品質(zhì)和抗逆形成的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)，為煙草遺傳改良提供新思路。

3.1 非靶向代謝譜分析方法在煙草中的應(yīng)用

近年來(lái)，基于GC-MS、LC-MS及NMR的煙草代謝譜分析方法逐漸建立與改進(jìn)，并被應(yīng)用于煙草抗性或品質(zhì)相關(guān)的代謝組學(xué)研究中[63-70]。目前，煙草品質(zhì)性狀相關(guān)代謝組學(xué)研究主要集中在生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)煙草代謝影響研究方面。煙葉代謝物水平除受栽培品種影響外，還與土壤、海拔高度以及溫度、日照、降雨等氣候條件有關(guān)。因此，煙葉質(zhì)量和風(fēng)格受地域影響很大，如津巴布韋煙葉與中國(guó)煙葉。2011年，Li等建立了一種基于LC-MS/MS的煙葉代謝譜分析方法，該方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確、可靠，可從全局表征煙葉代謝組。利用建立的方法對(duì)津巴布韋和中國(guó)的煙葉進(jìn)行了區(qū)分，并找出了它們之間主要的差異代謝物[17]。在中國(guó)，朱尊權(quán)等通過(guò)比較各種進(jìn)口煙葉與國(guó)產(chǎn)不同地方各等級(jí)煙葉的香味特征，將我國(guó)煙葉分為濃香型、清香型、中間香型3種，其中，河南地區(qū)煙葉表現(xiàn)出典型的濃香特征；云南地區(qū)煙葉表現(xiàn)出清香特征；貴州地區(qū)煙葉則既有清香特征也有濃香特征，將其定為中間香型[71]。河南、云南、貴州地區(qū)煙葉的代謝差異研究篩選出了影響不同地區(qū)煙葉香味特征的差異代謝物，將為我國(guó)香型的確立提供理論依據(jù)[68-70]。另外，GC-MS與LC-MS的聯(lián)合使用有效地?cái)U(kuò)展了煙草代謝譜的范圍，提供了更多有價(jià)值的代謝信息[69-70]。

除了研究生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)煙草代謝物影響外，代謝組學(xué)也被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因煙草的評(píng)價(jià)[63]、鹽脅迫與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[64]、信號(hào)分子等對(duì)煙葉代謝物的影響研究[65]。2005年，胡群等[72]研究了植物毒素類似物6-取代陰丹士藍(lán)異亮氨酸共軛物對(duì)煙次生代謝產(chǎn)物成分的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)1 mM 6-取代陰丹士藍(lán)異亮氨酸共軛物處理過(guò)的煙葉多生成法呢烯、檀香醇和十四醛三種揮發(fā)性化合物，且其它發(fā)揮性成分的含量也發(fā)生了變化。評(píng)吸結(jié)果顯示，誘導(dǎo)煙草次生代謝產(chǎn)物有助于提高和改善卷煙品質(zhì)。

3.2 代謝物靶標(biāo)分析方法在煙草中的應(yīng)用

非靶向的代謝譜分析方法無(wú)需對(duì)代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，可從全局表征煙葉在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)（基因的改變或環(huán)境的變化）后其代謝產(chǎn)物的變化，有利于全面了解煙葉信息并發(fā)現(xiàn)重要的未知代謝物。為進(jìn)一步了解煙葉中特定代謝物（如香味物質(zhì)）含量在不同環(huán)境、栽培、調(diào)制與加工過(guò)程中的變化，則需代謝物靶標(biāo)分析方法的輔助。植物次生代謝物與機(jī)體的抗性、信號(hào)傳導(dǎo)以及植物的花色、香味等現(xiàn)象有關(guān)，因此，通過(guò)代謝物靶向分析方法，研究煙草中的煙堿以及主要香味前體物質(zhì)，如萜類、酚類、醇類、酮類、酯類等次生代謝物含量的變化對(duì)于了解煙草主要香氣物質(zhì)的次生代謝途徑、改善煙葉香味品質(zhì)具有重要作用。

3.2.1 次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生途徑與煙草香味物質(zhì)的關(guān)系研究

在次生代謝中，香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化、分解為香味物質(zhì)，如異戊二烯代謝途徑可產(chǎn)生萜烯類化合物類胡蘿卜素，而類胡蘿卜素可降解產(chǎn)生二氫獼猴桃內(nèi)酯、茄酮、紫羅蘭酮、大馬酮、香葉基丙酮等多種重要香味物質(zhì)[73]。與煙草主要香味物質(zhì)有關(guān)的次生代謝途徑主要有苯丙烷代謝途徑、異戊二烯代謝途徑和生物堿合成途徑等[74]。在這些途徑中，一些酶對(duì)煙草香味物質(zhì)的產(chǎn)生起著重要作用，通過(guò)基因手段調(diào)控這些關(guān)鍵酶的活性是改良煙草香氣品質(zhì)的手段之一。2014年，符新妍等[75]通過(guò)測(cè)定烤煙中部葉有機(jī)酸總量、蘋果酸和檸檬酸含量、代謝相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化，探討了烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中葉片主要非揮發(fā)性有機(jī)酸含量及代謝相關(guān)酶活性變化規(guī)律。結(jié)果表明，蘋果酸含量與蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）活性之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，而檸檬酸含量與檸檬酸合成酶（CS）活性之間呈極顯著正相關(guān)。因此，可通過(guò)調(diào)控NAD-MDH和CS活性來(lái)調(diào)節(jié)蘋果酸和檸檬酸的含量，協(xié)調(diào)“酸堿比”，提高煙葉質(zhì)量。

3.2.2 不同生態(tài)環(huán)境對(duì)煙草次生代謝物的影響研究

次生代謝物是生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。因此，煙草中次生代謝物受光照、海拔、水分、溫度等生態(tài)因子影響較大。檢測(cè)不同環(huán)境條件下煙草香味物質(zhì)的變化，可以了解不同的外界環(huán)境對(duì)煙草體中香味物質(zhì)合成與積累的影響。2012年，耿召良等[76]以貴州不同產(chǎn)區(qū)煙葉為對(duì)象，考察了生態(tài)條件和種質(zhì)因素對(duì)烤煙次生代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸類、生物堿、多酚類、甾醇類）含量的影響。結(jié)果表明，生態(tài)條件對(duì)煙葉次生代謝產(chǎn)物含量影響明顯，而種質(zhì)因素對(duì)煙葉次生代謝產(chǎn)物影響較小，該結(jié)果與Zhang等[68]對(duì)云南、貴州和河南三地區(qū)煙葉中代謝物分析結(jié)果一致。2009年，黃勇等[77]考察了UV-B對(duì)煙草次生代謝的影響，結(jié)果表明UV-B處理的煙葉其葉綠素、糖和煙堿含量下降程度與輻射強(qiáng)度正相關(guān)，但微量適宜強(qiáng)度UV-B處理可使烤煙葉綠素、總類胡蘿卜素和總糖含量提高。另外，UV-B輻射可使與植物抗逆性有關(guān)的多酚含量顯著提高。2011年，喬瑞麗等[78]研究了不同環(huán)境因子對(duì)煙草中茄尼醇含量的影響，結(jié)果表明遮陰處理會(huì)使煙葉中茄尼醇含量降低，適量紫外光處理會(huì)增加茄尼醇含量，而適量的稀土元素也能促進(jìn)茄尼醇的合成。2013年，梁太波等[79]研究了干旱條件下外源甜菜堿和脯氨酸對(duì)烤煙抗氧化代謝的影響，結(jié)果表明，干旱脅迫下，噴施甜菜堿和脯氨酸均能不同程度提高烤煙葉片葉綠素含量和烤煙葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性，促進(jìn)脯氨酸的積累，同時(shí)降低丙二醛（MDA）含量，這是施用甜菜堿和脯氨酸可提高烤煙抗旱能力的主要原因。

3.2.3 不同栽培條件對(duì)煙草次生代謝物的影響研究

種植密度和留葉數(shù)、適當(dāng)?shù)氖┓省⒋蝽敽湍ㄨ疽约笆褂蒙L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等栽培措施都會(huì)影響煙葉的品質(zhì)。根據(jù)各地區(qū)的自然環(huán)境特點(diǎn)，找到最合適的栽培方式，將有助于最大限度地發(fā)揮各煙區(qū)的自然優(yōu)勢(shì)，彰顯各地區(qū)烤煙的風(fēng)格特色。2013年，張小全等[80]考察了氮素對(duì)烤煙基因型間香味物質(zhì)的影響，結(jié)果表明，各基因型煙葉中類胡蘿卜素和液面分泌物含量在中氮水平下最高；而不同基因型烤煙氮素的代謝積累差異較大；隨氮用量增加，烤煙新品系8306煙葉中性香氣物質(zhì)總量升高，K326煙葉則降低。因此，在以提高煙葉香氣基礎(chǔ)物質(zhì)含量為目標(biāo)的栽培管理中要根據(jù)品種特點(diǎn)進(jìn)行氮肥運(yùn)籌。2014年，李飛等[81]研究表明烤煙成熟前期氮代謝旺盛有利于類胡蘿卜素的形成，而成熟后期氮代謝強(qiáng)度減弱有利于類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的形成；烤煙成熟期氮代謝活性低，硝酸鹽積累，多酚的形成受到抑制。2014年，仝延鵬等[82]探討了精制有機(jī)肥對(duì)烤煙化學(xué)成分及香氣物質(zhì)含量的影響，結(jié)果表明，精制有機(jī)肥可降低烤煙中、上部煙葉煙堿含量，提高中部葉鉀含量和香氣物質(zhì)含量，尤其是巨豆三烯酮、苯甲醇、苯乙醇和新植二烯的含量。

3.3 代謝組學(xué)思想（非靶向分析方法）在煙草中的應(yīng)用

卷煙是通過(guò)煙葉的栽培、調(diào)制與加工而得到的制品，期間化學(xué)成分發(fā)生了一系列的變化，包括外源化合物（如香精香料）的加入。基于代謝組學(xué)思想，對(duì)煙葉或煙氣中化學(xué)成分進(jìn)行全分析，然后應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)獲得的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和可視化分析，并篩選出重要的差異化合物，對(duì)開發(fā)優(yōu)質(zhì)特色煙葉、葉組配方、新的香精香料，優(yōu)化卷煙工藝條件及評(píng)價(jià)卷煙質(zhì)量工藝具有重要意義。[83]目前，代謝組學(xué)思想在煙葉分模塊加工、梗絲質(zhì)量改善、卷煙煙氣差異化分析等方面已有應(yīng)用[84-86]。雖然這些應(yīng)用尚不成熟，但隨著多交叉學(xué)科發(fā)展逐漸成熟及卷煙工藝和質(zhì)量要求的日益增高，代謝組學(xué)思想在煙草中的應(yīng)用也將與日俱增。

4 小結(jié)與展望

隨著NMR、GC-MS、LC-MS及直接進(jìn)樣高分辨質(zhì)譜等分析技術(shù)的飛速發(fā)展和創(chuàng)新，代謝組學(xué)為植物代謝研究提供了新的視角，也為人們更全面、更多維地理解植物代謝提供了可能。但沒(méi)有一種分析技術(shù)能夠單獨(dú)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本中所有代謝物的一次性分析，每種方法都有其缺陷，如NMR靈敏度不高，LC-MS化合物鑒定問(wèn)題及GC-MS前處理繁瑣等。因此，如何開發(fā)一種高通量、高分辨率和高靈敏的分析技術(shù)是目前代謝組學(xué)亟需解決的問(wèn)題。基于代謝組學(xué)整體性、系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性的研究特點(diǎn)，其研究過(guò)程中所用到的檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)處理方法都要滿足高通量、大規(guī)模的要求，單一化研究已不能滿足實(shí)際需求，因此多種技術(shù)整合已成為代謝組學(xué)發(fā)展主要趨勢(shì)[87]。

代謝組學(xué)將煙草作為一個(gè)整體研究，可提供更全面的煙草化學(xué)成分信息，將化學(xué)成分變化與內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)聯(lián)，進(jìn)而可篩選出有益成分和有害成分。因此，代謝組學(xué)方法可為我國(guó)卷煙開發(fā)和質(zhì)量控制提供一套客觀、可靠、系統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法。

作為一個(gè)新興的學(xué)科，植物代謝組學(xué)在煙草中的應(yīng)用還面臨許多技術(shù)上的困難和挑戰(zhàn)，如樣品制備的自動(dòng)化、代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與其他組學(xué)數(shù)據(jù)整合方法的優(yōu)化以及代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定等。但隨著分離檢測(cè)技術(shù)的提高以及生物信息學(xué)的發(fā)展，代謝組學(xué)將在煙草基因功能解析、揭示代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)理和提高煙草品質(zhì)等生物技術(shù)應(yīng)用方面發(fā)揮不可替代的作用。

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Plant metabolomics and its application in tobacco

ZHANG Li, JI Houwei, HUANG Xijuan, WANG Fang, LIU Jian
Technology Center, China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd, Guiyang 550009, China

As one important platform of systems biology, metabolomics focuses on changes of low molecule weight metabolites in a biological system which were imposed by perturbations, including genetic or environmental factors.It has been widely used in different research fields, i.e.natural medicines development, botany, microbiology, and food safety.This paper reviewed the formation and development, research methods and its application in tobacco.The prospect of its further development and application were explored.Metabolomics will play a signi fi cant role in functional annotation of tobacco genome, revelation the mechanism of metabolic regulatory networks, and improvement of tobacco quality.

plant metabolomics; tobacco; application

張麗，姬厚偉，黃錫娟,等.植物代謝組學(xué)及其在煙草上的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2015,21（5）

貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（201019）

張麗（1987—），碩士，助理工程師，主要從事煙草及卷煙煙氣分析與檢測(cè)工作，Tel：0851-83981473，Email: zhanglishancha@163.com

劉劍 （1974—），博士，高級(jí)工程師，主要從事煙草及煙氣化學(xué)分析，Tel：0851-83981463，Email：liuj1208@163.com

2014-09-12

:ZHANG Li, JI Houwei, HUANG Xijuan, et al.Plant metabolomics and its application in tobacco [J].Acta Tabacaria Sinica,2015, 21(5)