微生物利用非蛋白氮合成菌體蛋白的研究進展

張魯新， 李呂木，2*

（1.安徽農業大學生命科學學院，安徽合肥 230036；2.安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036）

非蛋白氮即非蛋白質狀態的含氮化合物，包括有機物和無機物。動物營養學中，非蛋白氮指飼料中蛋白質以外的含氮化合物的總稱，包括游離氨基酸、蛋白質降解的含氮化合物、尿素及其衍生物類、氨及銨鹽類化合物和酰胺類化合物 （韓曉平，2013）。尿素及其衍生物類包括尿素、縮二脲、縮三脲、磷酸脲、羥甲基尿素、亞異丁基二脲、硬脂酸尿素等。氨及銨鹽包括液氨、磷酸銨、硫酸銨、氯化銨、甲酸銨、硝酸銨、聚磷酸銨、乳酸銨、氰酸銨、碳酸氫銨、氨基甲酸銨等。酰胺化合物包括谷酰胺、天冬酰胺和雙氰胺等。本文對微生物利用非蛋白氮的機理以及一些微生物利用非蛋白氮轉化為優質菌體蛋白的最新研究進展進行綜述，以期為飼用微生物蛋白的開發提供參考。

1 微生物利用非蛋白氮的機理

自然界中多種微生物可以利用非蛋白氮類物質合成自身生長需要的蛋白質，微生物在體內酶的作用下將非蛋白含氮物質降解為氨，氨在酶的催化作用下進一步被同化為氨基酸，氨基酸經過體內的代謝最終生成菌體蛋白。

1.1 微生物利用氨及銨鹽類轉化為菌體蛋白的機理 氨及銨鹽類物質在微生物生長基質中解離為銨離子，微生物吸收銨離子進入體內并在谷氨酰胺合成酶的作用下與谷氨酸反應生成谷氨酰胺（Geisseler等，2010），轉氨酶催化谷氨酰胺發生轉氨基作用進而合成其他氨基酸，多種氨基酸作為蛋白質合成的前體物質經過蛋白質合成酶的催化合成微生物菌體蛋白。此外微生物直接利用α-酮戊二酸和NH3在谷氨酸合酶的作用下生成谷氨酸（Jo等，2012），谷氨酸和氨通過上述過程轉化為菌體蛋白，此為微生物利用氨的另一種途徑。微生物同化氨及銨鹽類物質為菌體蛋白最重要的酶是微生物谷氨酰胺合成酶，因為該酶在無機氮轉化為有機氮過程中起著重要的橋梁作用，為后續微生物蛋白質的生物合成提供最基本的前體物質。

1.2 微生物利用尿素及其衍生物轉化為菌體蛋白的機理 尿素及其衍生物不能直接被微生物同化為菌體蛋白質，而是要轉變為其他易被微生物吸收利用的非蛋白氮物質而被微生物利用。尿素主要通過兩種途徑被微生物利用。第一種途徑是，尿素被微生物分泌的脲酶催化降解為氨和二氧化碳（Balasubramanian 等，2013），氨通過 1.1 中介紹的途徑最終轉化為微生物蛋白質。第二種途徑是，尿素首先經尿素羧化酶（UC）催化生成脲基甲酸酯，生成的脲基甲酸酯被脲基甲酸酯水解酶分解為銨和二氧化碳（Kanamori等，2004）。其中銨被微生物吸收，繼而經過1.1中介紹的途徑最終生成菌體蛋白。Merloni等（2014）報道，脲酶屬于金屬離子依賴型催化酶，它的催化活性依賴于結合在其活性位點的鎳離子，非活性脫輔基脲酶轉化為活性全息脲酶需要兩個鎳離子插入底物結合位點，這個過程需要UreD、Uref、UreG和UreE 4個輔助蛋白參與完成。因此在添加尿素及其衍生物作為氮源供微生物生長利用的基質中必須要有適量的鎳離子存在，以保證微生物對非蛋白氮類物質的利用。尿素羧化酶廣泛分布在許多細菌、藻類和真菌體內，它能催化尿素轉化為脲基甲酸酯，這個過程是生物體利用尿素作為氮源的基本步驟（Strope 等，2011）。 Tong（2013）報道，尿素羧化酶屬于生物素依賴性羧化酶家族，和家族其他酶具有相同的生物素羧化酶和生物素羧基載體蛋白結構域，但其羧基轉移酶結構域與家族其他酶截然不同。Fan等（2012）在對乳酸克魯維酵母尿素羧化酶的晶體結構研究中發現，生物素羧基載體蛋白結構域與羧基轉移酶結構域相互作用將生物素和尿素綁定在其活性位點進而催化尿素轉化為脲基甲酸酯。脲基甲酸酯水解酶存在于很多生物中，并且是生物利用尿素作為氮源必不可少的酶。Fan等（2013）在對乳酸克魯維酵母脲基甲酸酯水解酶晶體結構研究中發現，其N和C結構域催化兩步反應并保持酶的二聚體形式，其二聚體形式是保證酶最佳活性所必須，此外C結構域催化一種新穎的脫羧反應，這種反應普遍存在于生物系統。

2 不同微生物對非蛋白氮的利用

微生物可以利用廉價的廢料生成自身的菌體蛋白。常用來生產菌體蛋白的微生物種類有某些藻類、真菌和細菌。藻類含有豐富的蛋白質、脂肪和維生素 A、B、C、D、E（Raposo等，2013）。 藻類本身的核酸含量低，作為飼料對動物健康危害小，有很好的開發前途。Wang等（2011）報道真菌蛋白的氨基酸組成平衡，而細菌雖含有較高的蛋白質和某些必需氨基酸，粗蛋白質含量占干重的80%，但是含有較高的核酸，特別是RNA占到干重的15%～16%，而核酸在降解代謝過程中會產生尿酸，過多的尿酸在動物體內沉積于關節等處，引發痛風對動物成長有害 （Zare等，2006）。這對細菌作為飼料蛋白源產生非常不利的影響。

2.1 真菌利用非蛋白氮合成菌體蛋白

2.1.1 假絲酵母 產朊假絲酵母又叫食用圓酵母，是一種易消化、營養豐富的食用酵母，其中含有超過50%的蛋白質，富含賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、谷氨酸、礦物質及煙酸、泛酸 和B族維生素。

Watanabe等（2013）利用產朊假絲酵母處理燒酒廢水生產飼料酵母，培育出一個可以累積大量氮的產朊假絲酵母突變體。用其處理高濃度的燒酒廢水，可去除未稀釋的大麥燒酒廢水中62.9%有機物、38.4%總氮、44.5%總磷，每升處理后的大麥燒酒廢水經冷凍干燥得到大約16.7 g酵母生物量，其中含有約60%的粗蛋白質，用H2SO4調控pH值，不僅可提高廢水硫含量，而且還可增加酵母沉淀生物質中蛋氨酸的含量。Jebasingh等（2013）研究報道，產朊假絲酵母在18.81 g/L的糖濃度、8.71 g/L的硫酸銨和0.69 g/L的硫酸鎂的條件下，可以獲得6.69 g/L生物質，蛋白質含量可達50%以上；樹木假絲酵母在18.42 g/L的糖濃度、8.95 g/L的硫酸銨和0.66 g/L硫酸鎂的條件下，可得到6.74 g/L生物量，蛋白質含量可達49.37%。產朊假絲酵母可利用尿素和硫酸銨作為氮源合成谷胱甘肽，尿素和硫酸銨用作合成谷胱甘肽氮源的最佳C/N比分別為5.6和8.3。與硫酸銨相比，尿素轉化成谷胱甘肽的效率更高 （Wang等，2010）。在初始糖濃度為20 g/L香蕉皮水解物、9.59 g/L （NH4）2SO4、3 g/L KH2PO4、5.72 g/L L-蛋氨酸和0.20 g/L硫酸鎂條件下，產朊假絲酵母可利用香蕉皮的水解物高效生產谷胱甘肽，最大細胞干重和谷胱甘肽量可分別達到7.68 g/L和111.33 mg/L（kuforiji和 Aboaba，2010）。

Chen等（2011）報道熱帶假絲酵母蛋白質含量高，尤其是具有較高賴氨酸和色氨酸水平。熱帶假絲酵母已經應用于低蛋白質食品原料的蛋白質富集，如發酵玉米和木薯混合物時混合物蛋白質含量提高至20%，熱帶假絲酵母在3.5%果糖作為碳源和0.2%尿素作為氮源24 h干物質平均生成率達1.4 g/L。解脂假絲酵母在pH值為5.5，添加50 g/L甘油、1 g/L硫酸銨及其他營養物質時，可獲得17.8 g/L的最大生物量濃度、18.2%的蛋白含量和3.1%總蛋白產量。解脂假絲酵母培養在粗甘油培養基比培養在分析級甘油培養基培養生物量濃度、蛋白質含量和總蛋白量分別提高1.2、1.5、1.9 倍（Santos等，2010）。

2.1.2 其他真菌 米曲霉在0.75%的尿素條件下發酵木薯漿4 d，蛋白質和氨基氮含量由2.59%和0.89%分別提高到17.4%和15.13%（Thongkratok 等，2010）。研究表明，綠色木霉生產效率高，對氮源的要求低，是生產真菌生物蛋白最好菌株，它在不添加氮源的情況下經過搖瓶發酵可產超過5 g/L的真菌生物質，而米曲霉和黑曲霉在加入0.5～1.0 g/L的（NH4）2SO4條件下生成5 g/L的真菌生物質。米曲霉和黑曲霉菌株產生的生物質含有約36%的蛋白質，而綠色木霉產生的生物質含有19.8%的蛋白質，米曲霉和黑曲霉具有較高的蛋白質含量，可以利用（NH4）2SO4生產真菌蛋白 （Zhang等，2009）。卵形孢球托霉也可用來合成蛋白質，在5%尿素和初始水分70%條件下，發酵蘋果渣，可產生19.63%可溶性蛋白（Vendruscolo 等，2009）。

2.2 藻類對非蛋白氮的利用 藻類含有進行光合作用的光合色素，能吸收外界環境的含氮物質轉化為自身的蛋白質。小球藻不僅蛋白質含量高，氨基酸組成合理，還含有豐富的生物活性物質（Lodgelvry 等，2014）。 Mahboob 等（2012）以尿素為氮源，在10 L照明玻璃反應器中純培養耐熱小球藻，獲得的小球藻類富含60%的粗蛋白質，并含有0.52%類胡蘿卜素。淡水小球藻以尿素為氮源，葡萄糖為碳源進行分批補料發酵，67 h內其干物質平均生長率可達 1.22 g/L（Doucha 和 Livansky，2012）。

3 小結

微生物菌體蛋白早已作為蛋白質飼料添加劑應用于動物養殖中，但現階段微生物對非蛋白氮的有效轉化率仍不高。因此，在微生物菌體蛋白的生產中采用基因工程方法以及其他分子生物學手段，選育非蛋白氮高效利用菌，以及利用創新技術設計高效的生物反應器，提高非蛋白氮的轉化率均將推動非蛋白氮轉化為微生物蛋白產業的發展，并可促進發酵蛋白飼料生產過程中蛋白質含量的有效提高。同時，在研究非蛋白氮轉化為微生物蛋白的同時，結合進行含糖量高的廢棄物作為碳源的協同研究，將有利于促進非蛋白氮轉化為微生物蛋白的進程。

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