BJO對EC109細胞增殖和凋亡作用的研究

羅衛民 郭家龍 劉華 劉斌 羅湘玉 羅玲 張軍

442000湖北省十堰市太和醫院胸心大血管外科1

430000武漢華中科技大學同濟醫學院神經內科2

BJO對EC109細胞增殖和凋亡作用的研究

羅衛民1郭家龍1劉華1劉斌2羅湘玉1羅玲1張軍1

442000湖北省十堰市太和醫院胸心大血管外科1

430000武漢華中科技大學同濟醫學院神經內科2

目的：探討不同濃度的鴉膽子油乳對食管癌EC109細胞增殖和凋亡的作用。方法：利用MTT法檢測食管癌EC109細胞增殖，應用流式細胞術和Hoechest33342法測細胞凋亡。結果：鴉膽子油乳對管癌EC109細胞增殖和凋亡具有作用并且具有劑量依賴性作用。結論：鴉膽子可通過對細胞的形態，對細胞周期、對凋亡基因及細胞免疫功能的影響來抑制腫瘤細胞的增殖。

鴉膽子油乳；食管癌細胞；細胞增殖和凋亡

鴉膽子油乳在臨床中被應用于多種惡性腫瘤的輔助治療，但在食管癌中的作用機制尚未明確。本文研究鴉膽子油乳對食管癌細胞作用的機制，為該藥在食管癌治療中的應用提供證據。

資料與方法

傳代培養食管癌EC109細胞。

實驗分組：將生長良好的細胞分為正常細胞對照組和A、B、C 3個試驗組，試驗組中分別加入藥物濃度為5 μg/ mL、10 μg/mL、20 μg/mL的鴉膽子油乳，繼續培養48 h。

MTT法檢測EC9706細胞增殖：①MTT溶液配置：稱取250 mg MTT，加50 mL PBS，在電磁力攪拌機上攪拌30 min，用直徑0.22 μm的微孔過濾器除菌，分裝，4℃保存，2周內使用。②取對數期生長的EC109細胞1瓶，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養液配成單細胞懸液，計數，接種4×103/孔濃度的細胞150 μL于96孔培養板，共種3塊培養板。置5%CO2，飽和濕度37℃溫箱中繼續培養。③EC109細胞培養16 h后更換培養基，每孔加入180 μL DMEM培養液，按不同分組進行細胞轉染后，繼續置5% CO2，飽和濕度37℃溫箱中繼續培養。④各組EC109細胞培養24 h、48 h及72 h后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)溫箱內繼續孵育。4 h后，小心吸棄孔內液體，加150 μL二甲基亞砜溶解沉淀，振蕩l0 min，溶解結晶物。⑤比色：選擇570 nm波長，空白對照調零，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A值)，記錄結果，描繪MTT增殖曲線。

流式細胞術檢測EC9706細胞凋亡：①在細胞轉染72 h后，分別收集6孔板中分組培養的細胞的細胞培養液，之后常規消化細胞。細胞消化下來后，分別加入上步驟中所收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。②取5～10萬重懸的細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。③加入 5 μ L Annexin V-FITC，輕輕混勻。④20～25℃避光孵育10 min。⑤1 000 g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。⑥加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。⑦隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

Hoechest33342法測凋亡：①取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡至少5 min，無菌超凈臺內吹干或用細胞培養級PBS洗滌3遍，再用細胞培養液洗滌1遍。將蓋玻片置于6孔板內，種入細胞培養過夜，使約為50%～80%滿。②按不同分組進行細胞轉染后，吸盡培養液，加入固定液，固定10 min。③去固定液，用PBS洗兩遍，吸盡液體。④加入終濃度10 μg/mL的Hoechst33342染色液，染色5 min。手動晃動數次。⑤用PBS洗2遍。⑥將貼有細胞的蓋玻片蓋于載玻片上，盡量避免氣泡。⑦熒光顯微鏡檢測。

結果

鴉膽子油乳對管癌EC109細胞增殖和凋亡具有作用。不同濃度的鴉膽子油乳具有劑量依賴性作用。

討論

鴉膽子對腫瘤細胞的作用：①鴉膽子對細胞形態的影響：鴉膽子可以使細胞變圓，胞漿濃縮，細胞內出現大小不等的空泡，泡內容物電子密度與基質相似，細胞核不規則，染色質邊集濃縮，呈斷裂狀，部分線粒體腫脹、空泡化，可見凋亡小體形成。②鴉膽子對細胞周期的影響：鴉膽子油乳對癌細胞G0、G1、S、G2、M期有殺傷和抑制作用，能明顯抑制腫瘤細胞DNA的合成，該藥能直接進入癌細胞，通過影響質膜系統和線粒體，使之變性壞死。③鴉膽子對bcl-2基因的影響：bax功能與bcl-2截然相反，是促進細胞死亡的基因，兩者在細胞中常協同表達，形成同源二聚體，按其比值共同調控著細胞的凋亡過程。研究發現，經鴉膽子油乳作用后p53和Bcl-2在肝癌細胞中的表達均下降。

鴉膽子對細胞免疫功能的影響：鴉膽子油乳注射液用于晚期肺癌的化療組外周CD3+、CD4+、CD8+、CD5+明顯升高。說明鴉膽子油乳注射液聯合化療比單用化療能明顯提高機體免疫功能，且可減少化療不良反應。

綜上所述，鴉膽子可通過對細胞的形態，對細胞周期、對凋亡基因及細胞免疫功能的影響來抑制腫瘤細胞的增值。

[1]李英,徐功立,李穎,等.鴉膽子油乳誘導白血病U937細胞凋亡的實驗研究[J].中華血液學雜志,2004,25(6):381.

[2]劉悅王,禾符,庚慶吉,等.鴉膽子油乳對膀胱癌影響的實驗研究[J].中華泌尿外科雜志,2001,22(6):336-338.

[3]韓宇,楊承漢.食管癌中nm-32H1基因突變與癌轉移的關系[J].新鄉醫學院學報,2001, 18(4):238-239.

Research of BJO on EC109 cell proliferation and apoptosis

Luo Weimin1,Guo Jialong1,Liu Hua1,Liu Bin2,Luo Xiangyu1,Luo Ling1,Zhang Jun1
Department of Chest Big Vascular Surgery,Taihe Hospital,Shiyan City,Hubei Province 4420001
Department of Internal Medicine-Neurology,Wuhan Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology 4300002

Objective:To investigate the effect of Brucea javanica oil emulsion with different concentrations on the proliferation and apoptosis of esophageal cancer EC109 cells.Methods:We detected the proliferation of esophageal cancer cell line EC109 by used the MTT method,measured the cell apoptosis by flow cytometry and Hoechest33342 method.Results:Brucea javanica oil emulsion had the effect on proliferation and apoptosis of cancer cells EC109 tube and has a dose dependent effect.Conclusion: Brucea Javanica can through the effect of cell morphology,cell cycle,apoptosis gene and cell immune function to inhibit the proliferation of tumor cells.

Brucea javanica oil emulsion;Esophageal cancer cells;Cell proliferation and apoptosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.7.2