PCR技術在結核病診斷中的價值

卞永娟136000吉林省四平市結核病醫院檢驗科

PCR技術在結核病診斷中的價值

卞永娟
136000吉林省四平市結核病醫院檢驗科

目的：探討PCR技術在結核病診斷中的價值。方法：收治結核病患者282例，分析其臨床資料，同時與濃縮集菌涂片法進行對比。結果：PCR法的陽性率明顯高于濃縮集菌涂片法（χ2=12.397，P＜0.05）。檢測中發現，濃縮集菌陽性的標本，PCR法也均為陽性，敏感度100％。結論：PCR技術在結核病診斷中具有重要的價值。

結核?。籔CR技術；診斷

結核病是世界范圍內日益嚴重的公共衛生問題之一，是由結核分枝桿菌所致的以呼吸系統感染為主的慢性傳染病，發病率與致死率均較高。該病可累及全身各個系統，臨床表現多種多樣，尤其是肺外結核往往十分隱匿，給臨床診斷帶來極大的困難。實驗室檢測是結核病診斷、治療及預防控制的重要依據，是消滅結核病傳染源、切斷傳播途徑、控制流行的重要環節［1-5］。現對我院2014年1月-2015年3月住院確診的結核病患者282例的臨床資料進行統計分析，同時與濃縮集菌涂片法進行對比，探討PCR技術在結核病診斷中的臨床價值。

資料與方法

2014年1月-2015年3月收治結核病患者282例，男155例，女127例，年齡12～86歲，平均（35.4±6.5）歲。結核病診斷標準：肺結核的診斷符合中華醫學會結核病學分會制定的《結核病診斷指南》中肺結核診斷標準。肺外結核：①有肺結核慢性中毒癥狀，如發熱、盜汗、消瘦等；②PPD實驗強陽性或血抗結核抗體≥2項陽性；③痰結核桿菌培養陽性；④影像學檢查具有符合結核病的特征；⑤診斷性試驗抗結核治療有效。取患者的臨床標本進行檢測，其中痰液240例，胸腹水26例，腦脊液16例。

方法：濃縮集菌涂片法先集菌后檢查，可提高檢出率。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉淀集菌。處理后的材料再離心沉淀。取沉淀物做涂片染色鏡檢。應用PCR法檢測標本中結核分枝桿菌的方法可分2個步驟：結核分枝桿菌DNA的提取、PCR擴增和擴增產物的檢測。①標本DNA的提?。簶吮炯?～3倍體積的4％NaOH液化、離心、沉淀，加入50μL DNA提取液，煮沸10 min，離心5min，取上清液5μL待用。②PCR擴增和擴增產物的檢測：Tap酶0.5μL加15.5μL反應液充分混勻后加石蠟油20μL封頂，再加入4μL標本DNA提取液，離心后在擴增儀中擴增，93℃45 s，55℃45 s，72℃1min，持續35個循環，然后72℃5min。之后將上清液5μL加入擴增后的反應管中，充分混勻后取下層藍色液體15μL。電泳25min后在紫外檢測儀上觀察。若在227 bp處顯現橙黃色色帶，提示結核桿菌陽性。

統計學處理：采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料比較采用t檢驗，計數資料以％表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

用PCR法對282例臨床標本中的結核桿菌進行快速檢測，同時與濃縮集菌涂片法結果進行比較，PCR法的陽性率明顯高于濃縮集菌涂片法（χ2=12.397，P＜0.05）。檢測中發現，濃縮集菌陽性的標本，PCR法也均為陽性，敏感度100％。見表1。

討論

結核病是嚴重危害人們健康的傳染病之一，涂片法和改良羅氏培養法一直以來是傳統檢測方法，但涂片法特異性差、陽性率低、敏感性低。培養法所需時間長，一般需要3～8周，且感染者早期不易檢出病菌，嚴重影響疾病的正確診斷［6］。PCR是一種體外酶促擴增特異DNA片段技術，是以目的基因為模板，利用針對目的基因所設計的一對特異寡核苷酸引物進行的DNA體外合成反應。PCR技術在結核病細菌學診斷上的敏感、快速的特點在多數報道中得到了肯定［7-9］。本組試驗也充分表明，PCR法的陽性率明顯高于濃縮集菌涂片法。檢測中同時發現，濃縮集菌陽性的標本，PCR法也均為陽性，敏感度100％。目前，在經典PCR技術的基礎上，各種新的適用于不同目的的PCR方法不斷出現，已經發展了多種適用于各種場合和需求的PCR方法。依據MTB重復序列、蛋白質編碼基因或rRNA基因設計的特異引物，通過PCR技術可從多種臨床標本（如胸腔積液、腦脊液）中檢測出結核分枝桿菌DNA。且PCR擴增的拷貝數越多，靈敏度就越高。因此，可檢測1～100 fg純化的結核分枝桿菌DNA，相當于1～20個結核分枝桿菌，而且用時只需1～2 d。與傳統方法相比，如常規抗酸染色，每1mL痰液需含5 000個以上菌才能檢出，且非結核分枝桿菌或其他細菌、孢子等抗酸染色亦為陽性。培養法需3～8周，而且必須是活菌。由此可見，PCR檢測的陽性率明顯高于常規細菌學方法。即使在試管內難以生長的少量菌，甚至死菌釋放的未降解的DNA也能檢測出來。這對于培養及涂片均為陰性的結核病患者的早期診斷與鑒別診斷，以及化療后排菌情況的觀察是很有益的。

Value of tuberculosis laboratory PCR in the diagnosis of tuberculosis

Bian Yongjuan
DepartmentofLaboratory ofTuberculosis Hospital in Siping City,Jilin Province 136000

Objective：To discuss the value of PCR in the diagnosis of tuberculosis.Methods：282 patientswith tuberculosiswere selected.We analyzed the clinical data and compared the concentration of smear technique.Results：The positive rate of PCR was significantly higher than that of condensingmethod（χ2=12.397，P＜0.05）.In the detection,condensing bacteria samples were positive,PCRwere positive,and the sensitivitywas100％.Conclusion：PCR playsan important role in the diagnosisof tuberculosis. Key words Tuberculosis；PCR technology；Diagnosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.24.77