華山松松塔提取物抗HIV活性部位中鉛含量的測(cè)定

張 楨，孫幫燕，郭貴唐，羅建蓉

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/昆明市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科中心實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650028;2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000)

病原體為人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)的疾病，臨床上稱其為獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquiredimmune deficiency syndrome/AIDS)。如果機(jī)體感染HIV，那么機(jī)體的免疫細(xì)胞功能將會(huì)衰退且免疫細(xì)胞數(shù)量會(huì)衰退，導(dǎo)致機(jī)體增加惡性腫瘤發(fā)生機(jī)率或感染，最終導(dǎo)致感染者死亡。HIV不僅嚴(yán)重威脅著人類的健康，而且阻礙全球經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展［1］。目前，盡管美國(guó)批準(zhǔn)上市的HIV的藥物有20多種，但是價(jià)格昂貴、毒副作用大，作用環(huán)節(jié)單一，易出現(xiàn)耐藥性［2－3］。

松科松屬植物資源豐富，全世界約100多種。我國(guó)松屬植物分布極廣，合計(jì)50余種(有22種，10個(gè)變種，引進(jìn)16種，2個(gè)變種)［4］。據(jù)《本草綱目》記載，松塔具有祛痰、祛風(fēng)、止咳平喘、安神和潤(rùn)腸等功效［5］。在我國(guó)，已有13種被列入藥用的松屬植物，其能入藥部位主要為松塔及松子、松針、松脂、松節(jié)等。從目前松塔研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，松塔中含有多糖、酚類、木質(zhì)素類、萜類、黃酮類多種化學(xué)成分，且發(fā)現(xiàn)松塔藥理活性具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫力等作用［6－8］。

盡管中華人民共和國(guó)藥典把13種松屬植物列入藥用，但目前報(bào)道松屬的松塔藥用開(kāi)發(fā)不是很多，尤其關(guān)于松塔抗HIV藥用的研究報(bào)道很少［9］。為此，筆者對(duì)采集于云南省巍山縣的華山松(Pinus armandii Franch.)松塔進(jìn)行研究，測(cè)定松塔提取物中(抗HIV治療指數(shù)＞30)鉛的含量，為進(jìn)一步研究抗HIV藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 取干燥的華山松(P.armandii Franch.)松塔(生藥學(xué)馬曉寬教授鑒定)5 kg，粉碎，用一定濃度的乙醇(90%)在室溫條件下提取2次(2×9 L)，每次12 h。過(guò)濾，殘?jiān)盟萏崛。^(guò)濾后殘?jiān)屑訅A液(濃度4%氫氧化鈉)浸泡提取，過(guò)濾，向得到的堿性濾液加入酸(用乙酸調(diào)pH)，濃縮到適量體積，加入乙醇混勻，靜置12 h，過(guò)濾得到粗提取物Ⅰ;在濾液中繼續(xù)加醇液，靜置12 h，過(guò)濾得到粗提取物Ⅱ;濾液中再加醇液，靜置12 h，過(guò)濾得到粗提取物Ⅲ。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定條件。波長(zhǎng)為 283.1 nm［5］;背景校正為塞曼效應(yīng);狹縫 0.7 nm;樣品進(jìn)樣量 17 μl，0.5% 基體改進(jìn)劑硝酸鎂和硝酸鈀的混合液3 μl，高純氬氣為保護(hù)氣(250 ml/min)。升溫程序(表1):第1次干燥溫度110℃，坡升時(shí)間1 s，持續(xù)時(shí)間30 s;第2次干燥溫度130℃，坡升時(shí)間15 s，持續(xù)時(shí)間30 s;灰化溫度850℃，坡升時(shí)間10 s，持續(xù)時(shí)間20 s;原子化溫度1 600℃，坡升時(shí)間0 s，持續(xù)5 s;凈化溫度2 450℃，坡升時(shí)間1 s，持續(xù)時(shí)間3 s。

表1 升溫程序

1.2.2 鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備。精密量取鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)液(GB08619)適量，用濃度2%硝酸溶液稀釋，即得1 μg/ml鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，冰箱中0～5℃保存［5］。精密量取鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用濃度2%硝酸溶液稀釋，配制400 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液(用時(shí)現(xiàn)配)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別精密量取鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 ml于 25 ml容量瓶中，用濃度2%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得0、5、10、20、40、80、160 ng/ml的溶液。按“1.2.1”用自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣，于石墨爐原子吸收光譜儀上測(cè)試。扣除試劑空白，以吸光度值(A)對(duì)鉛濃度(C，ng/ml)做線性回歸處理，回歸方程為:A=0.002 85C+0.003 93，相關(guān)系數(shù)(r)=0.999 0，線性范圍為0 ～200 ng/ml。

1.2.4 樣品測(cè)定。參照中華人民共和國(guó)藥典［2010版附錄Ⅸ B 鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定法(一部)(B 法)］處理標(biāo)本［5］，分別精密稱取3種抗HIV活性部位(治療指數(shù)＞30)［4］樣品0.20 g，置三角瓶中，加硝酸/高氯酸(4∶1)10 ml，瓶口加一小漏斗，浸泡過(guò)夜，在通風(fēng)廚里置電熱板上加熱消解，保持微沸，直至濃煙散盡，消解液呈透明，再加去離子水，待白煙散盡，定容至25 ml。同時(shí)，制備空白液，按測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn)。取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，按“1.2.4”項(xiàng)中的方法和步驟進(jìn)行操作，重復(fù)測(cè)定吸光度6次。表2表明，樣品Ⅰ～ⅢRSD 分別為1.50%、1.77%、1.53%，說(shuō)明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，按“1.2.4”項(xiàng)中的方法和步驟進(jìn)行操作，每隔20 min測(cè)定一次吸光度。表3表明，2 h內(nèi)顏色變化較小，不影響測(cè)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.1.3 回收率試驗(yàn)。采用加標(biāo)回收法，取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，加入 0.5 ～2.0 倍標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.4”項(xiàng)中的方法和步驟進(jìn)行操作，測(cè)定其吸光度，并且計(jì)算回收率。表4表明，平均回收率為99.79%，RSD 為 4.45%。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 方法檢出限。參照中華人民共和國(guó)對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》［10］，該法檢出限為 5.0 μg/kg。

2.1.5 評(píng)價(jià)結(jié)果。采用《中國(guó)藥典》［5］(2010 年版)和中華人民共和國(guó)對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》［10］重金屬最高限定的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，提取物Ⅰ～Ⅲ鉛含量分別為3.41、2.71、2.92 mg/kg，低于中華人民共和國(guó)對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(Pb≤5.0 mg/kg)和《中國(guó)藥典》(2010年版)重金屬最高限定的標(biāo)準(zhǔn)(Pb≤5.0 mg/kg);超標(biāo)率為0。

3 討論

在取樣和樣品消解過(guò)稱中，所有玻璃儀器均需以16.67%硝酸浸泡過(guò)夜，用水反復(fù)沖洗，最后用去離子水沖洗，以免污染試樣。石墨爐原子吸收光譜分析法是一種靈敏度高、適合測(cè)定鉛的測(cè)試技術(shù)，但是存在基體干擾嚴(yán)重等缺點(diǎn)，故在石墨爐原子吸收分光光度分析工作中，應(yīng)注意背景和其他原因引起的對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。如，儀器工作原子化條件可能影響儀器的靈敏度、穩(wěn)定程度。試驗(yàn)中，選擇塞曼效應(yīng)為背景校正系統(tǒng)［7］。該研究表明，濃度0.5%硝酸鎂和硝酸鈀是一種良好的基體改進(jìn)劑，因此在校準(zhǔn)曲線和標(biāo)本測(cè)試過(guò)程中，設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器同時(shí)加入改進(jìn)劑，就可以滿足測(cè)定需要，減少測(cè)試步驟，避免基體干擾測(cè)試結(jié)果。按提取工藝對(duì)采自于云南省巍山縣的華山松(Pinus armandii Franch.)松塔進(jìn)行處理，得到抗HIV活性部位鉛含量沒(méi)有超標(biāo)。

［1］劉武青，李磊珂，鄭永唐，等.中藥復(fù)方?jīng)霾杼崛∥矬w外抗HIV活性研究［J］.中藥材，2010，33(9):1433－1437.

［2］張楨，張鵬，劉光明，等.華山松松塔中抗HIV活性部位多糖的含量測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(10):2435－2436.

［3］劉光明，呂永俊，李好枝，等.云南松松塔中抗HIV活性成分研究初報(bào)［J］.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8(2):69.

［4］鄭萬(wàn)均.中國(guó)樹(shù)木志［M］.北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1983:148.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010版［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［6］NAGATA K，SAKAGAMI H，HARADA H，et al.Inhibition of influenza virus infection by pine cone antitumor substances ［J］.Antiviral Res，1990，13(1):11－21.

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［9］張楨，李春艷，劉光明，等.華山松松塔體外抗HIV活性的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25(1):25－26.

［10］中華人民共和國(guó)對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易合作部.藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.