激素對蟬擬青霉胞內核苷合成的影響

陳安徽，邵 穎，李繼武，韓富海

(1.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，徐州工程學院，江蘇徐州221008;2.安徽省亳州千草藥業有限公司，安徽亳州236800)

蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)隸屬麥角菌科(Clavicepitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，又名雌蟬花、蟬棒束孢(Isaria cicadae)，是我國傳統中藥材蟬花(Corcyceps sobolifera)的分生孢子即無性型階段［1－4］。研究表明，蟬擬青霉的人工發酵培養物中含有多種與天然野生蟬花相同的活性成分，有些活性成分的含量甚至高于野生蟬花及同屬的冬蟲夏草。李瑞雪等［5］采用反相高效液相色譜法對蟬擬青霉RCEF1081人工發酵菌絲體中的活性成分進行分析，發現其中蟲草素和鳥苷含量是冬蟲夏草的2.8倍。葛飛等［6］通過檢測發現蟬擬青霉RCEF0943菌株液體發酵菌絲體中的腺苷含量顯著高于野生蟬花。核苷類物質特別是腺苷是蟲草屬真菌的主要功能性活性成分，具有調節中樞神經系統中的不同生理過程、抑制中樞神經元的興奮性、增加冠狀動脈血流量、降血壓、減慢心率及抗腫瘤等重要的生理作用［7－10］。現代研究表明激素對微生物的生長發育會產生特定的影響［11－12］。

筆者以6-芐氨基嘌呤(6-BA)和3-吲哚乙酸為考察對象，探索2種激素對蟬擬青霉液體發酵過程中菌絲體生長及胞內總核苷、胞內腺苷合成的影響，為人工蟲草資源的開發與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種與試劑。菌種:蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)菌種保存于食品工程學院發酵工程實驗室。試劑:3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、腺苷、尿苷、胞苷、鳥苷標準品，美國Sigma公司;95%乙醇等均為國產分析純。

1.1.2 培養基。固體斜面培養基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%、瓊脂2%;種子培養基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%;液體培養基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%。

1.1.3 儀器與設備。梅特勒電子天平，AE200型，上海分析儀器廠;手提式壓力蒸汽滅菌器，YXQ.SG4﹨.280，上海華線醫用核子儀器有限公司;Freeze Dry Systems(冷凍干燥系統)，040520111G，美國LABCONCO公司;SENCO R-502B旋轉蒸發器，上海申勝生物技術公司;高效液相色譜儀LC3100，安徽皖儀科技股份有限公司;高效液相色譜紫外檢測器UV3100，安徽皖儀科技股份有限公司;分析柱Synergi Hydro(4.6 mm ×250 mm，4 μm)，美國 Waters公司;超凈工作臺，AIR TECH，蘇凈集團安泰公司;光照培養箱，LRH-250-G，廣東省醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種的發酵方法。6-BA、3-吲哚乙酸按照5 mg/L的添加比例添加到裝有200 ml液體培養基的500 ml三角瓶中，另配制不添加激素的培養基。于3種培養基中分別按照10%的接種量接種蟬擬青霉液體種子，25℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養并定期測定生物量及胞內核苷含量，每個試驗均重復3次。

1.2.2 生物量的測定及菌絲體的獲得。菌種培養過程中，每隔24 h取樣，獲得的發酵醪液抽濾后用蒸餾水反復沖洗菌絲體5次，菌絲體冷凍干燥后準確稱重。按照下式計算生物量，干燥菌絲體粉碎過100目篩，備胞內核苷含量的檢測。

生物量(g/L)=菌絲體干重(g)/發酵醪液體積(L)

1.2.3 胞內總核苷含量的檢測。準確稱取腺苷、尿苷、鳥苷、胞苷標準品各0.1 g定容至100 ml，得到4種標準樣品質量濃度均為1 mg/ml的混合標準品溶液。再將標準混合溶液稀釋并配制成0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/ml的溶液，采用分光光度計法測定溶液吸光值，并繪制標準曲線。

稱取干菌絲體0.1 g于試管中，加入20 ml 75%乙醇超聲萃取1 h后于4 000 r/min下離心15 min，上清液轉入25 ml容量瓶并定容。將溶液再稀釋為0.04 mg/ml后以75%的乙醇作為空白對照測定溶液吸光值。

1.2.4 胞內腺苷含量的檢測。腺苷標準曲線的繪制:準確稱取腺苷標準品0.01 g置于10 ml容量瓶中，用65%的乙醇定容至刻度;將標準液稀釋成 0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mg/ml的溶液進行HPLC分析并繪制腺苷標準曲線。

樣品檢測:稱取干菌絲體0.1 g于試管中，加入20 ml 75%乙醇超聲萃取1 h后于4 000 r/min下離心15 min，上清液轉入25 ml容量瓶并定容。溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾后得樣品液，樣品液經適當稀釋進行HPLC分析。

高效液相色譜條件:0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液為A液，甲醇為B液，洗脫梯度設置為:100%A液5 min、80%A液+20%B液5 min、60%A液+40%B 液20 min、100%B 液10 min、100%A 液10 min;流速 1.0 ml/min，柱溫 25 ℃，UV 檢測波長:260 nm;進樣量:20 μl。

1.3 數據處理與分析 采用DPS(V3.01)專業版數據統計分析軟件進行數據統計分析。數據統計結果均以平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 蟬擬青霉的生物量 由圖1可知，在該試驗條件下，6-BA和3-吲哚乙酸均有促進蟬擬青霉菌絲體合成的作用。其中6-BA試驗組的最大生物量為6.135 g/L，3-吲哚乙酸組的最大生物量為5.860 g/L，空白對照組最大生物量為5.151 g/L，2實驗組與空白對照組相比最大生物量分別提高了19.10%和13.76%，方差分析表明，差異達到顯著水平(P＜0.05)。

由圖1還可知，6-BA和3-吲哚乙酸試驗組蟬擬青霉的最大生物量比對照組提前1 d到達，很大程度上縮短了蟬擬青霉的發酵周期。

2.2 胞內總核苷含量的變化 以各質量濃度的標準品吸光值為縱坐標，總核苷標準品濃度為橫坐標，得到線性回歸方程為 Y=39.35X+0.027 1，R2=0.992 2，線性范圍為0.002 ～0.010 mg/ml，胞內總核苷含量標準曲線見圖2。

由表1可知，試驗組和對照組均在發酵第3天時胞內總核苷含量達到最大值。在發酵前期，2種激素并未對核苷含量產生影響，但在發酵第3天激素刺激蟬擬青霉胞內核苷急劇累積，6-BA和3-吲哚乙酸試驗組胞內總核苷含量分別達到最大值18.49 mg/g和16.77 mg/g，比對照組的最高含量11.19 mg/g分別提高了65.24%和49.87%。統計分析發現，2個試驗組胞內核苷的最高含量均顯著高于對照組(P＜0.05)。另外，6-BA試驗組在第3天總核苷量達到最高，但隨著發酵的進行總核苷含量迅速降低，而3-吲哚乙酸試驗組在發酵第3天胞內核苷含量達到最高后并未隨著發酵過程的推移出現急劇下降的趨勢。

2.3 胞內腺苷含量的變化 以不同質量濃度的腺苷標準溶液的HPLC峰面積進行回歸分析，得到腺苷含量的回歸方程為 Y=14.931X －82.34，R2=0.998 6，線性范圍為 0.025 ～0.200 mg/ml。在質量濃度范圍內，質量濃度與峰面積呈現良好線性關系。對各組樣品進行胞內腺苷含量的檢測，結果見表2。

由表2可知，6-BA和3-吲哚乙酸均對蟬擬青霉液體發酵過程中胞內腺苷的合成產生一定的影響。3-吲哚乙酸試驗組胞內腺苷含量較6-BA組和對照組提前24h達到最大值。6-BA顯著提高了胞內腺苷的含量，最高含量達到2.32 mg/g，比對照組和3-吲哚乙酸試驗組胞內腺苷的最高含量分別提高了32.57%和27.47%。6-BA更有利于蟬擬青霉胞內腺苷的合成。

表1 激素對蟬擬青霉發酵總核苷的影響 mg/g

表2 激素對蟬擬青霉發酵產腺苷的影響 mg/g

3 討論

隨著天然蟲草資源的枯竭，蟲草已遠無法滿足市場需求。蟲草無性型菌株液體發酵菌絲體作為天然蟲草資源的代用品越來越得到人們的追捧。蟲草菌株的液體發酵及活性物質的研究開發逐漸成為研究熱點。大量研究表明植物激素和動物激素均可調控微生物的生長發育過程，激素作為有效的基因開關可以促進細胞中靶基因的表達及物質的合成。該研究在蟬擬青霉液體深層發酵過程中添加6-BA和3-吲哚乙酸2種激素以考察激素對蟬擬青霉代謝途徑的影響。該試驗條件下，向蟬擬青霉液體培養基中按照5 mg/L的比例添加6-BA和3-吲哚乙酸，發現2種激素對蟬擬青霉生物量、胞內總核苷和胞內腺苷的含量均產生了一定的影響。6-BA與3-吲哚乙酸組生物量較對照組提前1 d達到最大值，大大縮短了蟬擬青霉的發酵周期，同時2種激素也促進了胞內總核苷和腺苷的合成。腺苷是蟲草屬真菌的主要活性成分之一，目前已作為檢測蟲草類制品質量的重要質控指標，2種激素在蟬擬青霉液體深層發酵過程中的添加對于提高蟲草相關制品品質發揮了積極作用，同時也說明激素確實會改變微生物的代謝途徑及生長節奏。至于激素對蟬擬青霉液體發酵過程中代謝產生其他活性成分的影響程度及激素不同添加量對活性物質累積的影響有待于進一步研究。

激素在蟬擬青霉液體發酵過程中的添加可以縮短發酵周期，提高胞內總核苷和腺苷的含量。該研究的開展將為蟬花有效代用品的開發提供途徑，為蟲草資源的有效應用提供參考。

［1］王碩，趙小京，唐法娣.蟬花藥理作用的初步探討［J］.浙江中醫雜志，2001，36(5):219 －220.

［2］王春雷，蘆柏震，侯桂蘭.中國蟬花的研究進展［J］.中國藥學雜志，2006，41(4):244－247.

［3］賀亮，馬素云，程俊文，等.藥用真菌蟬擬青霉生物活性物質的研究進展［J］.食品與生物技術學報，2012，31(1):8－16.

［4］李瑞雪，汪泰初，胡飛，等.蟬擬青霉中蟲草素提取工藝研究［J］.食品科技，2013，38(2):218－221.

［5］李瑞雪，胡飛，陳安徽，等.4種蟲草無性型真菌中核苷類成分比較分析［J］.食品與發酵工業，2007，33(11):111－114.

［6］葛飛，夏成潤，李春如，等.蟬擬青霉菌絲體與天然蟬花中化學成分的比較分析［J］.菌物學報，2007，26(1):68－75.

［7］謝煒，郭月芳，盛雨辰.蟬花菌絲體對慢性腎功能衰竭大鼠的治療作用［J］.中國醫藥工業雜志，2011，42(10):770－772.

［8］金麗琴，呂建新，袁謙，等.蟬擬青霉對大鼠免疫功能和血液生化指標的影響［J］.溫州醫學院學報，2001，31(6):344－346.

［9］BOISON D.Adenosine as a modulator of brain activity［J］.Drug News Perspect，2007，20(10):607 －611.

［10］RIKSEN N P，RONGEN G A，YELLON D，et al.Human in vivo research on the vascular effects of adenosine［J］.European Journal of Pharmacology，2008，585:220－227.

［11］汪宇，于榮敏.蛹蟲草液體培養條件的優化及生長動力學考察［J］.中國野生植物資源，2003，22(4):56－61.

［12］陳安徽，王衛東，陳宏偉，等.激素對蟬擬青霉深層液體發酵生長代謝的調控作用［J］.食品科學，2010，31(23):317 －321.