十字花科作物根腫病生防菌研究進展

彭麗莎, 袁天成, 李成瓊, 任雪松, 宋洪元, 司 軍

(西南大學園藝園林學院,重慶市蔬菜學重點實驗室,南方山地園藝學教育部重點實驗室, 重慶 400715)

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十字花科作物根腫病生防菌研究進展

彭麗莎, 袁天成, 李成瓊, 任雪松, 宋洪元, 司 軍*

(西南大學園藝園林學院,重慶市蔬菜學重點實驗室,南方山地園藝學教育部重點實驗室, 重慶 400715)

根腫病嚴重危害油菜、白菜、甘藍、芥菜在內的十字花科作物,因此研究一種有效的防治方法以降低該病害的發生是非常重要的。十字花科作物根腫病的病原菌—根腫菌能以休眠孢子的形式長期存在于土壤中,一旦環境條件適宜即可萌發并迅速傳播。生防菌是從拮抗病原菌和誘導植物抗性的角度尋求防治病害的一種方法。作者首先對獲得十字花科作物根腫病生防菌的方法進行闡述,重點總結了生防菌的來源和篩選的方法。為了更好地利用生防菌,又簡要綜述了生防菌菌株的分類鑒定、發酵及拮抗物質等方面的研究進展,分析了施用生防菌的方式和時間。并指出了目前存在的問題及開發應用的前景。

十字花科; 根腫病; 生防菌; 生物防效

十字花科作物根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)侵染引起的土傳病害[1-4],該病主要危害十字花科作物的根部。導致生長素、細胞分裂素[5-7]以及油菜素甾醇[8]的過度合成,從而引起主根和側根形成大量腫瘤,嚴重者整株枯死[9-10],造成嚴重的經濟損失。根腫菌專性寄生于十字花科作物,在土壤中可長期存活,土壤一旦帶菌將不再適合栽植十字花科作物。因此,該病嚴重威脅著十字花科作物的可持續發展。

國內外雖已進行了大量針對該病原菌防治技術的研究,但目前仍無根治的方法。選用抗病品種是防治根腫病的有效方法之一,根據Williams[11]和Buczacki等[12]建立的歐洲鑒別寄主系統(European clubroot differential set,ECD)將根腫菌分為24個生理小種,因此要選育具有普遍抗性(即水平抗性)的品種難度非常大。輪作能在一定程度上緩解根腫病情[13-15],但增加了侵染十字花科雜草的機會,仍然不能從根本上消滅根腫菌。化學藥劑治理雖有一定效果,但同時也有諸多副作用,如農藥殘留、環境污染、病原菌產生抗藥性、破壞土壤微生態環境等。隨著生活質量的提高,人們對生態農業的關注也日益加深,利用微生物防治病蟲害也越來越受到重視。Arie等[16]首次報道利用葡萄莖枯病菌(Phomaglomerata)JCM 9972可以抑制根腫菌休眠孢子的萌發。最新的研究表明生防菌不僅有抗菌活性,還可以誘導寄主植物產生抗性[17-18]。生防菌為控制該病提供了一條新的有效途徑。近年來在利用微生物防治十字花科作物根腫病方面的研究取得了較大進展。本文將對十字花科作物根腫病的微生物防治研究進展做簡要綜述,旨在為根腫病生防菌的開發利用提供參考。

1 生防菌的獲得

1.1 生防菌的來源

按材料來源,生防菌主要分為內生生防菌和非內生生防菌兩類。非內生生防菌即從根際土壤中分離篩選所得的生防菌。土壤中微生物的多樣性為從土壤中分離生防菌提供了保證,取材時應取發病地中未發病或病害等級較低植株的根際土壤,以提高從中篩選出生防菌的可能性。國內外常有從富含微生物的土壤中篩選生防菌的報道。國外學者得到的25株對根腫菌有拮抗活性的木霉屬生防菌均是從種植商品品種無根腫病癥狀的土壤中分離的[19]。蘇婷等[20]從不同地區土壤中分離出細菌596株,其中解淀粉芽胞桿菌BS2004經周青等[21]證實其兼具抑制番茄青枯病和蕓薹根腫菌的作用。王靖等[22]從白菜根際土壤中分離得到拮抗根腫菌的放線菌A316。

農藥和化肥的大量使用降低了土壤中微生物的多樣性,給根際土壤生防菌的篩選帶來了一定困難。內生菌因受到植物組織的保護而免受外界環境的影響,所處的生態環境穩定且能與病菌直接作用。因而從植物組織中篩選出生防菌的可能性更大,更易于發揮生防作用。內生生防菌廣泛分布于植物組織中,與植物形成互惠共生關系[23-25],大量研究表明內生菌是植物土傳病害防治的天然有效菌[26-27],具有一定研究價值和開發應用前景。Narisawa等[28-29]以及Hashiba等[30]從白菜根系中分離出2株內生生防菌Heteroconiumchaetospira和Phialocephalafortinii,分別接種該生防菌的白菜田間根腫病發病率可降低52%～97%。Hahm等[31]也從白菜組織中分離出黃桿菌屬內生細菌FlavobacteriumhercynimEPB-C313,可以在一定程度上抑制根腫病的發生。生命力旺盛且抗病力強的植株體內可能蘊含著豐富的微生物資源,因此可以擴大范圍甚至跨科采集生防菌原始材料,以篩選優良的生防菌菌株。如王靖等[32]從雅安紅豆樹根部和銀杏樹根部分別成功分離出放線菌A10和真菌T1,具有較高生防潛力。

1.2 生防菌的分離純化和篩選

從材料中獲取的微生物需要進一步分離純化,方法同常用的分離純化微生物的方法,多采用稀釋涂布法和平板畫線法。兩種方法都應該在分別適合細菌、真菌、放線菌生長的培養基上進行。所不同的是用稀釋涂布法分離純化微生物時,需要根據微生物數量的多少做預試驗找到適當的稀釋比[33]。

蕓薹根腫菌是一種專性活體寄生菌,不容易體外培養[34-35],因而也很難得到人工純培養的根腫菌來篩選根腫病生防菌。目前根腫病生防菌的篩選方法主要有活體鑒定法、休眠孢子萌發抑制率篩選法及病原指示菌篩選法等。活體鑒定法費地費時費力,一般在復篩階段開始采用,以準確確定初篩菌株的生物防效。休眠孢子萌發抑制率篩選法即通過檢測微生物對根腫菌休眠孢子萌發的抑制作用來篩選生防菌。該種方法也存在一定缺陷,并不是所有具生防潛力的微生物都可以抑制根腫菌休眠孢子的萌發。如J?schke等[36]在篩選擬南芥根腫病的生防菌時發現芳香頂孢霉(Acremoniumalternatum)孢子對根腫菌休眠孢子的萌發無抑制作用,卻能在一定程度上抑制根腫病的發生。孫良菲等[37]將病原指示菌篩選法和休眠孢子萌發抑制率篩選法結合使用篩選出2株生防菌株放線菌YN-6和真菌XP-F2對感病品種‘四季奶油小白菜’有生物防效。病原指示菌篩選法和休眠孢子萌發抑制率篩選法結合起來的具體做法是挑選能人工培養的病菌作為病原指示菌,先篩選出對幾種病菌有拮抗效果的菌株作為測定休眠孢子萌發抑制率的候選菌株。兩者結合使用既克服了前者目標性不強的缺點,又克服了后者由于根腫菌不能體外培養而難以篩選的不足。

2 菌株的分類鑒定

經分離純化篩選得到的生防效果較好的生防菌需要確定其在進化中的地位,以便后續工作的順利開展。以往的研究常依靠形態學特征和生理生化特征進行菌株分類鑒定。常規鑒定方法檢測指標多、工作量大,且單純依靠常規方法難以達到準確鑒定的目的。如果生防菌是真菌,因為菌落、菌絲體和孢子特別是大型真菌的子實體和孢子的形態特征容易觀察和比較,所以常規鑒定方法對于真菌的鑒定依然很重要。常規鑒定方法的局限性限制了菌株分類鑒定的發展,越來越多的分類單元鑒定需要結合分子生物學技術和自動鑒定系統才能實現。基因序列分析法和Biolog微生物自動鑒定系統是目前國際上常用的分類鑒定方法[38]。rDNA-ITS序列分析法、18S rDNA和16S rDNA序列分析法是基因序列分析法中常用的3種分類鑒定方法。其中rDNA-ITS序列分析法是對核糖體RNA基因(即rDNA)內轉錄間隔區(ITS)的多態性序列進行PCR擴增,獲得ITS全序列信息,經測序后與基因庫中的片段進行對比分析,就可得知未知菌與基因庫中已知菌的相似度,從而完成對菌株分類單位的鑒定以明確真菌的分類地位。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的基因。16S rRNA長度在1 500 bp左右,所代表的信息量適中,是研究原核分類的理想材料。根據16S rDNA兩端的保守序列設計引物,擴增16S rRNA基因的未知部分,再測序和已知細菌的序列對比分析確定病原細菌的分類地位。Lee等[39]運用16S rDNA序列分析法把從韓國田間種植的白菜上分離得到的81株內生放線菌劃分為8個不同的屬,其中最常見的是小雙孢菌屬(67%),其次是鏈霉菌屬(12%)和小單孢菌屬(11%)。并且通過室內盆栽試驗,以細胞壁成分、形態特征和系統發育為依據,將其中能有效抑制根腫病的3株生防菌確定為玫瑰小雙孢菌(A004和A011)和橄欖色鏈霉菌(A018)。范成明等[40-41]采用細菌通用引物P0和P6,于2007年在國內首次將16S rDNA序列分析法用于根腫病生防菌的鑒定,經比對并結合形態特征發現生防菌XF-1屬枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。王靖等[22]采用PCR引物27F、1492R,將生防放線菌菌株A316鑒定為灰紅鏈霉菌,結合形態與培養特征、生理生化特性把菌株A10劃分至鏈霉菌灰褐類群。18S rDNA 序列分析法與16S rDNA 序列分析法類似,所不同的是,前者用于鑒定真菌。

然而基因序列分析法和Biolog微生物自動鑒定系統仍然有缺陷。基因序列分析法可以準確地將菌株鑒定到屬,但使用的前提是基因庫中存在和擴增序列同源的片段;并且這種方法不能將種間遺傳距離非常近的菌株的分類地位確定到種的水平。美國Biolog公司以碳源的利用情況為基礎研制開發的Biolog微生物自動鑒定系統可用于包括根腫病生防菌在內的各種微生物的鑒定,然而檢測結果發現只能測定微生物的部分性狀,容易產生誤判[42],具有一定的局限性。因此,將借助于分子生物學等手段的新方法與常規方法結合使用以更加準確地鑒定根腫病生防菌更為可取。

3 生防菌的發酵

獲得了優良的生防菌菌株之后,建立合理的培養及發酵體系,擴大培養發酵才能實現大面積的推廣應用。對生防菌的發酵過程進行合理優化,可以提高目的產物的產量并有效降低發酵成本,為其在生產中應用奠定基礎。發酵過程包括菌株自身的性能、發酵培養基的組成以及合適的環境條件等。王靖[43]首先采用單因素分析方法確定最佳的培養基組成(含大豆粉、酵母膏、葡萄糖及蛋白胨等),再采用復合因素分析方法(正交設計)確定最優的培養條件組合(包括種子液種齡、接種量、初始pH、裝液量、溫度、搖床轉速及發酵時間等),確定菌株A316和A10的較佳培養基組成及理想的發酵培養條件。除此之外,響應面設計、均勻設計、模式識別法、二次正交旋轉組合法、遺傳算法和神經網絡等[44]分析方法也可用于培養條件的優化,應根據實際情況合理選擇以上分析方法。另外,在生防菌株的生理代謝和合成調控機制未知的情況之下,可通過搖瓶培養先用Plackett-Burman法確定出重要因素,然后用響應面優化設計法或均勻設計法得到各重要因素的最佳水平[45],從而篩選適宜的培養體系。

4 拮抗物質的分離與鑒定

微生物代謝物質對土傳病害的防治作用也是國內外學者關注的熱點。曾有報道指出生防菌葡萄莖枯病菌JCM 9972對根腫病有一定防治作用,其控制根腫病發生的拮抗物質是發酵液中的頂環氧菌素[16]。賈媛等[46]采用鹽酸和甲醇抽提法從枯草芽胞桿菌XF-1中分離出拮抗物質而后用其處理根腫菌休眠孢子,9 d后發現休眠孢子萌發的相對抑制率在90%以上。Li等使用層析分離技術從枯草芽胞桿菌XF-1分離出一種抗菌肽芬薺素類型環肽(fengycin-type cyclopeptides)[47],并用它(250 mg/mL)處理根腫菌休眠孢子,24 h后幾乎觀察不到完整的休眠孢子細胞[48]。拮抗物質可能存在于真菌的菌絲體和發酵液中,如存在于菌絲體中,則需要先用有機溶劑進行浸取,使樣品從菌絲體中轉移到有機溶劑中。王靖[43]發現在生防放線菌A316的菌絲體和發酵液中均含有拮抗物質,采用80%的丙酮浸泡24 h后,離心去除菌絲體,真空旋轉蒸干,而后用10%甲醇溶解得到菌絲體浸泡液。將菌絲體浸泡液過濾后與發酵上清液合并置于正丁醇中萃取并經過薄層層析、硅膠柱層析等過程,最終分離純化獲得抗根腫病活性成分。經氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用檢測分析發現化合物Ⅰ與通用型酚類抗氧劑2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)的匹配度高達97.84%;化合物Ⅱ與鄰苯二甲酸單乙基己基酯的匹配度為74.28%。除此之外,已報道對十字花科作物根腫病有拮抗作用的物質還有糖類細菌素[49]、幾丁質酶[50]等,這些活性物質對根腫病均有不同程度的抑制作用。

5 生防菌的生物防效

在溫室條件下進行試驗得到的生防效果屬于溫室生物防效。相較于大田生物防效,溫室生物防效通常會高于大田生物防效。多是直接將篩選得到的生防菌施用于植株的根際,也有的是利用生防菌分泌的拮抗物質。因為有學者研究發現同一種生防菌的細胞抑制休眠孢子的萌發率高于培養液高于培養濾液[31],表明直接用生防菌的生防潛力高于拮抗物質。在白菜移植前用F.hercynimEPB-C313培養液浸漬處理幼苗根系,對根腫病的抑制率可達100%[31]。內生生防菌可能需要在植株體內定殖以擴大生物量才能發揮拮抗作用,外國研究者通過光學和電子顯微鏡發現H.chaetospira在接種3周后才能進入根部表皮細胞[51],所以施用內生生防菌時應特別注意施用的時間。Wang等[52]的研究表明,A316菌株對白菜根腫病的溫室生物防效和大田生物防效都高于陽性對照—75%百菌清可濕性粉劑,且能使白菜的單產增加96.1%[22]。大田生物防效的處理是在栽植幼苗前用A316菌株的發酵液與上層15 cm 的土壤混勻,并在栽植10 d 和25 d 后各澆發酵液于根系一次[52]。王靖等[32]采用灌根法分別將生防菌A316、A10和T1的培養液澆油菜植株根部4次(播種前7 d、播種期、播種后10 d、 播種后25 d),研究結果顯示溫室生物防效依次為73.60%、70.94%、67.10%,大田生物防效分別是65.84%、59.59%、61.24%。將生防菌與適宜的有機肥混合,除了可以利用有機肥對土壤的緩沖作用以改善生防菌生存的環境條件,從而達到增強防效的目的;還能利用有機肥中本身含有的各種有益微生物的輔助功效,協同作用防治根腫病[53]。Lahlali等[54]的研究結果顯示加入枯草芽胞桿菌(B.subtilis) QST713自身產生的代謝物質有利于生防菌的定殖,同時還能使它與其他微生物之間的競爭最小化,也可間接提高防效。另外,一些研究者混合2種及2種以上的生防菌用于土傳病害的防治。如Peng等[55]混合枯草芽胞桿菌和海洋真菌鏈孢黏帚菌(Gliocladiumcatenulatum)2種生防菌使根腫病發生的嚴重程度降低80%以上。盡管混合的生防菌之間可能存在拮抗作用而降低生防效果,但是這種混合菌劑與單獨使用一種相比,可能更易于生防菌的定殖。綜合衡量拮抗作用和定殖情況,混合菌劑更有可能提高生防效果。

6 存在的問題和前景展望

6.1 存在的問題

生防菌由于對環境安全無污染而受到廣泛重視。我國十字花科作物根腫病生防菌研究起步較晚,與發達國家相比還存在一定的差距,目前仍存在諸多問題制約著生防菌的進一步推廣和應用。研究的一般程序是先分離、純化、培養,然后是初篩和復篩并鑒定菌株,最后是定殖狀況和發酵條件的研究。篩選、鑒定分別存在以下問題:其一,分離、純化和培養過程均是在人工培養基上進行,盡管嘗試采用多種人工培養基離體培養,仍然難以對生防效果較好卻無法人工培養的微生物進行篩選[56-57];其二,由于內生菌長期生活在植物組織內部并與宿主植物協同進化,當在人工培養基上培養時其形態特征必然發生一定的變化以適應其內生環境[58-59]。那么基于形態學分類標準的傳統鑒定方法就有可能無法正確反映內生生防菌的分類地位。另外初篩完成后復篩過程和防效試驗需要不斷地培養、繁殖和接種根腫菌,雖然此過程更加接近田間生長模式,但同時也存在病害傳播及大面積蔓延的風險[60]。

多數生防菌在實驗室內有較好的防效,在田間應用時卻不甚理想。究其原因一方面是生防菌(尤其是非內生生防菌)在農作物上難以定殖。生防菌不能很好地在土壤或植株中定殖便難以形成足夠數量的微生物群體,也就不能穩定發揮其防效。過高的農藥殘留可能也是導致微生物群體數量下降的原因之一。另一方面,目前的生物菌劑多是活菌,田間應用時極易受溫濕度、pH等環境條件的制約,從而影響生防菌發揮對根腫病的拮抗作用。

土壤中存在各種微生物群落,不同的微生物之間存在復雜的相互作用。根腫病生防菌的引入,可能對土壤中其他微生物的群落結構造成不同程度的改變,繼而打破固有的土壤微生態平衡。Roesti等[61]報道,接種PGPR假單胞菌和叢枝菌根真菌(AMF)對小麥根際土壤細菌群落有顯著影響。類似的結果還有,朱偉杰等[62]也發現生防菌對土壤微生物中細菌的生物量具有促進作用。生防菌的使用在短時間內可能對根腫菌有較好防效,但生防菌的加入同時也可能會影響土壤微生態平衡和降低生物多樣性[63],甚至導致新病害的出現。從長遠的角度考慮,應兼顧經濟效益、生態效益和社會效益,在有效防治根腫病的同時嚴格控制生防菌的引入量,以避免產生新的隱患。

6.2 前景展望

根腫病生防菌的開發利用,給根腫病的綜合防治提供了新的思路。如何使十字花科作物根腫病生防菌在生產上得到有效的推廣和應用是目前生防菌研究的主攻方向。為了達到提高生防效果的目的,除了改變生防菌的施用方式和掌握施用時間外,還可以把篩選出的生防菌加以誘變處理。常見誘變的方式有紫外線誘變[64]、氯化鋰誘變[65]、N+注入誘變[66]、微波誘變[67]、硫酸二乙酯誘變[68]等,上述誘變方式不僅可單獨處理還可復合使用。還可以利用現代分子生物學手段,將生防菌中的抗病基因整合到十字花科作物體內。Feng等[69]將潮霉素抗性基因(hph)整合到根腫菌的基因中得到含抗潮霉素活性的根腫菌,并將其接種到油菜上發現腫根可以形成。通過PCR和qPCR分析表明轉化的DNA仍然存在于根腫菌。這是首次報道遺傳轉化的根腫菌,將有利于根腫病植物病害系統多項領域的研究。這為生防菌和植物中的抗病基因整合到根腫菌體內提供技術支持。在分子水平提高抗病性,從根本上解決根腫病的危害問題。這也是未來生防菌研究的熱點。

由于根腫菌是寄生于十字花科作物的專性活體寄生菌,很難直接得到純培養的單孢菌系。Kageyama和Asano[70]試驗的結果表明采用單孢接種技術以及細胞懸浮培養技術可以對根腫菌進行離體培養,但不能獲得大量的腫根,該方法的適用性尚待驗證。探究根腫菌離體培養方法,建立科學實用的根腫菌離體培養體系,開發生防菌篩選新方法提高篩選效率仍然是當前迫切需要解決的問題。

理想的目標生防菌需具有高效、穩定等特性,實現其功能的最大化,最好兼具增產等功效。結合現代生物技術,加強對根腫病生防菌定殖、消長規律等基礎理論問題的研究,注重生防菌的田間防效,發掘和利用生防菌的防治潛力,提高生產應用價值,逐漸取代部分化學農藥的使用,實現低成本、安全、無污染、增產增質的目標,根腫病生物防治才有可能取得突破性進展。

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(責任編輯：田 喆)

Research progresses in biocontrol bacteria of the clubroot disease of the Cruciferae

Peng Lisha, Yuan Tiancheng, Li Chengqiong, Ren Xuesong, Song Hongyuan, Si Jun

(College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University, Chongqing Key Laboratory of Horticulture, Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715, China)

Clubroot is becoming a serious threat to cruciferous crops, includingBrassicanapus,B.pekinensis,B.oleracea,B.juncea. It is very important to develop an effective control method to reduce the occurrence of this disease.Plasmodiophorabrassicae, which causes clubroot disease in cruciferous crops, can form resting spores surviving for long periods in the soil. If the environmental conditions are suitable for the germination ofP.brassicaeresting spores, this disease spreads quickly. Biocontrol microorganisms suppress clubroot of cruciferous crops via antibiosis and induced host resistance. The present review focuses on research progresses in the methods of acquiring biocontrol microorganisms. We emphatically summarize the sources and screening methods of biocontrol microorganisms. In order to make better use of biocontrol microorganisms, advances in classification, fermentation and antagonistic substances of biocontrol microorganisms and an analysis of the methods and time for applying biocontrol microorganisms are reviewed. The problems to be solved and prospects for development and application were also discussed.

Cruciferae; clubroot disease; biocontrol microorganisms; biocontrol efficiency

2014-05-20

2014-07-04

國家科技支撐計劃項目(2012BAD02B01)；重慶市農作物良種創新工程(CSTC2012GG(80005))；中央高校基本科研業務費專項資金(XDJK2014C179，XDJK2014C181，XDJK2014A015)

S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.003

* 通信作者 E-mail：sijunxx@163.com