腦心通膠囊對慢性低灌注血管性癡呆小鼠神經保護作用研究

馬亞珂 楊 岳 趙步長 賈力夫 趙 菁 王 虹 余文文 張露莎

1.天津中醫藥大學中醫藥研究院 現代中藥國家重點實驗室（培育），天津 300193；2.陜西步長制藥有限公司，陜西西安 712000

血管性癡呆（vascular dementia）是由各種腦血管疾病如缺血性卒中、出血性卒中等所致的嚴重認知功能障礙綜合征，是一種慢性進行性疾病[1]。造成血管性癡呆的原因，主要有缺血性腦損傷、腦血流減少、腦動脈硬化及腦神經細胞病變等[2-3]。目前國內外對血管性癡呆的治療尚無確切的療法和藥物。腦心通膠囊是根據中醫理論在經典方劑的基礎上加味而成的中藥復方制劑，由黃芪、丹參、當歸、川芎、紅花、乳香、沒藥、桂枝、地龍及水蛭等16味中藥組成，具有益氣活血、化瘀通絡等功效。臨床大量數據證實腦心通膠囊對心腦血管性疾病具有較好的治療效果[4]。雙側頸總動脈微螺旋縮窄模型是新近出現的一種慢性低灌注缺血致血管性癡呆模型，更符合臨床血管性癡呆的病理特點（圖1）[5-6]，而國內鮮見應用該模型的報道。本研究采用該模型研究了腦心通膠囊對血管性癡呆的保護作用。

圖1 小鼠雙側頸總動脈微螺旋縮窄模型

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級C57BL/6小鼠64只，10周齡，雄性，平均體重（20.00±5.00）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。動物飼養于天津市實驗動物中心，分籠飼養，自由飲水，飼養溫度為22～25℃，相對濕度為40%～60%，每周更換墊料2次。

1.2 儀器與試劑

0.18 mm 金屬螺旋環（Microcoil，SWPA/0.08×0.18×0.5×2.5，無錫薩密你彈簧有限公司中國）；大小鼠行為分析系統（Clever.Sys.Inc，美國）；Y 迷宮（XR-XY1032上海欣軟信息科技有限公司，中國）；LEICA S8APO體視顯微鏡（型號 DFC295，LEICA，德國）；LSM710 顯微鏡（CarlZeiss LSM710，ZEISS，德國）。 腦心通膠囊（陜西步長制藥有限公司，國藥準字Z20025001）；Tempol（214000-25G，SIGMA-ALDRICH，中國）；異氟烷（河北一品制藥有限公司，國藥準字H19980141）；GFAP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，BA0056）；其他試劑為市售分析純。

1.3 方法

1.3.1 雙側頸總動脈微螺旋縮窄模型及實驗分組 54只C57BL/6小鼠行雙側頸總動脈縮窄術：三溴乙醇（0.33 mL/20 g）麻醉后，脫毛備皮并固定，置于體視顯微鏡下。縱向剪開頸部皮層，分離左側頸總動脈，將0.18 mm的金屬環套在頸總動脈血管上（圖1），將浸有生理鹽水的紗布覆蓋頸部。0.5 h后將其右側頸總動脈分離，將0.18 mm金屬環如前操作環套在右側頸總動脈上。縫合頸部，蘇醒后放回籠中。監測造模過程中慢性低灌注前后腦部血流變化。排除造模過程中出血死亡、術后未蘇醒及慢性低灌注后血流值未下降的小鼠，共納入45只小鼠。將造模成功的小鼠隨機分為模型組（n=15）、Tempol組（n=15）、腦心通組（n=15）。另設假手術組（n=10），假手術組除不做0.18 mm金屬環縮窄頸總動脈外，其他操作如上。假手術組、模型組術后 1 d 灌胃給予生理鹽水 0.01 mL/（g·d），Tempol組灌胃給予 10 mg/mL Tempol溶液 0.01 mL/（g·d），腦心通組灌胃給予 350 mg/（kg·d）腦心通膠囊，連續給藥28 d。

1.3.2 Y迷宮 術后28 d后進行Y迷宮實驗。由A臂放入，在3個臂中自由活動480 s，記錄480 s內小鼠在A、B、C三個臂的穿梭次數。按A、B、C三個臂選擇性穿梭的次數（即每次經過中心象限后均進入不同于上一次進入的象限，如ABC或CAB或ACB，而不是BAB或ACA）與總穿梭次數的比值，比值越大，說明小鼠的空間記憶能力越好[7]。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 連續給藥28 d后，磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛各25 mL心臟灌流。取出腦組織后4%多聚甲醛固定。24 h后放入自動脫水機中進行脫水，石蠟包埋切片，選擇海馬部位的切片進行常規HE染色，于光鏡下觀察海馬CA1區組織形態學改變。

1.3.4 星形膠質細胞激活 按照膠質細胞原纖維酸性蛋白（GFAP）試劑盒的說明進行SABC免疫組化染色（一抗稀釋比為1∶100；二抗是即用型抗體），具體操作如下：①石蠟切片常規脫蠟經乙醇脫水，PBS（pH 7.4）沖洗 5 min×3次；②3%H2O2室溫孵育 10 min，蒸餾水洗3次，PBS浸泡5 min；③置入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 6.0）的容器中，放入數控抗原熱修復儀中加熱至溫度達到120℃，保持15 min，然后排氣降溫，取出切片，自然冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次；④加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃封閉30 min；⑤傾去多余的封閉液，滴加適當稀釋的特異性一抗于切片上，4℃過夜；⑥PBS沖洗5 min×3次，除去PBS液，滴加生物素標記的二抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次；⑦滴加即用型 SABC溶液，37℃孵育 20 min，PBS沖洗 5 min×3次；⑧DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察染色強度，以控制反應時間，通常5～10 min，滴加蒸餾水終止反應；⑨蘇木精復染2 min，蒸餾水沖洗10 min，鹽酸酒精分化5 s，蒸餾水沖洗10 min；⑩梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。對照：用0.01 mol/L PBS代替一抗做陰性對照。拍照，觀察星形膠質細胞激活情況。定量分析計數方法：于海馬CA1區的錐體細胞層，在40×10倍光鏡下隨機選擇5個視野，計算每平方毫米內的陽性細胞數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t法檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Y迷宮實驗

自發交替百分比越大，表明動物空間記憶的能力越強。與假手術組比較，模型組小鼠慢性低灌注后空間記憶能力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，Tempol組、腦心通組進臂的自發交替百分比顯著增加（P＜0.05）。各組別之間的Y迷宮總進臂次數差異無統計學意義（P＞0.05），表明各組小鼠常規的移動未受到雙側頸總動脈縮窄和口服腦心通的影響。見表1。

表1 腦心通膠囊對慢性低灌注血管性癡呆小鼠空間記憶能力的影響

2.2 HE染色

假手術組海馬CA1區錐體細胞呈多層排列，且整齊緊密，結構清晰，分布均勻，神經細胞數目多，外形規則，細胞層3～5層，細胞圓形或橢圓形，染色較淡，染色質均勻，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯，呈均勻淡藍色或藍色；模型組海馬CA1區錐體細胞排列紊亂、稀疏，神經元細胞數目減少，可見嗜酸性神經細胞現象，細胞核體積變小，深染，呈固縮狀或僅呈現很淡的藍色甚至藍色消失，細胞周圍間隙增大，細胞內出現空腔，細胞間質成分顆粒狀分布明顯；與模型組比較，Tempol組、腦心通組神經細胞外形基本規則，細胞周圍間隙較模型組小，細胞空腔現象比模型組輕，細胞間質成分呈顯微排列，接近正常。見圖2（封三）。

2.3 星形膠質細胞激活

活化的星形膠質細胞經GFAP陽性染色后呈棕黃色，周圍有放射狀突起，呈分支狀，形態如蜘蛛樣。陰性對照切片未見GFAP免疫反應產物。結果見表2、圖3（封三）。假手術組C57BL/6小鼠的海馬區僅見少量GFAP染色陽性細胞數目，染色淺，突起細、短（圖3箭頭所示）；與假手術組比較，模型組C57BL/6小鼠的海馬CA1區GFAP染色陽性細胞數目明顯增多（P＜0.05），細胞深染，突起變長、增粗和分支增多；與模型組比較，Tempol組、腦心通組海馬CA1區GFAP染色數目減少（均P＜0.05），染色較淺，結構明顯改善，分枝少，胞體形態趨于正常。

表2 腦心通膠囊對星形膠質細胞GFAP表達的影響（±s）

表2 腦心通膠囊對星形膠質細胞GFAP表達的影響（±s）

注：與假手術組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，#P ＜ 0.05；GFAP：膠質細胞原纖維酸性蛋白

假手術組模型組Tempol組腦心通組6886 27.01±6.18 49.93±4.67*38.71±11.67#40.68±8.57#組別 只數 GFAP陽性細胞數（個/mm2）

3 討論

血管性癡呆嚴重影響著中老年人的健康，是亟待解決的醫學難題。慢性腦供血不足是血管性癡呆重要的誘發因素。從病理學上來說，腦白質損傷后海馬區發生反應性的神經膠質增生并發玻璃樣變或纖維化及腦部血管壁增厚的動脈硬化性病變等，此類病變可導致腦組織多區域的功能損傷[8]。目前國內對于慢性低灌注模型的構造多為結扎雙側頸總動脈[9-12]，對模擬臨床患者的實際情況有一定局限。本研究采用小鼠雙側頸總動脈微螺旋縮窄模型探討腦心通膠囊治療血管性癡呆的藥理作用，該模型對腦部進行慢性低灌注，腦部組織膠質細胞激活和白質損傷明顯，更符合臨床實際。

腦心通膠囊是在補陽還五湯的基礎上增加蟲類藥和活血化瘀藥而成的現代中藥復方制劑，在臨床上廣泛用于治療心腦血管性疾病[13]。相關文獻提示腦心通膠囊可以通過抑制與炎癥細胞因子及氧化應激反應有關的JAK2/STAT3信號轉導通路，抑制神經細胞凋亡，改善神經功能缺損，減輕缺血再灌注對大鼠腦神經細胞的損傷，發揮神經保護作用，降低腦水腫程度，提高小鼠空間記憶能力[14-15]。本研究結果提示，腦心通可以改善慢性低灌注血管性癡呆模型小鼠空間學習記憶能力及組織學病理形態。

本研究中采用Tempol作為陽性藥，是一種新型自由基清除劑。文獻[16-17]提示Tempol可清除自由基，抑制脂質過氧化，抑制神經細胞的氧化損傷；Tempol預處理可以改變腦組織的氧化環境，對缺血缺氧損傷的腦組織神經功能的恢復具有保護作用[16-20]。

星形膠質細胞是中樞神經系統內為數最多、功能復雜的一類神經膠質細胞，對神經元的存活、腦組織損傷的修復有重要作用[21-25]。星形膠質細胞在腦組織受損時明顯增加，早期的腦損傷應激性增加的星形膠質細胞可參與腦組織內相關修復作用，但過度增生的星形膠質細胞分泌相關抑制因子，參與瘢痕形成，影響神經纖維的傳導和突觸的構建，也可產生細胞炎性因子等，引發炎性反應，加快腦組織損傷[26-28]。GFAP是星形膠質細胞合成的重要骨架蛋白，GFAP表達程度可反映星形膠質細胞增生活躍程度。本研究發現腦心通膠囊可以抑制慢性低灌注損傷模型中星形膠質細胞活化，這可能是其神經保護作用機制之一。

[1]張梅，高吉國，趙騰，等.MCP-1與血管性癡呆[J].中國老年學雜志，2014，3（34）：1728-1730.

[2]GoldbergTH，GriffithJP.CanAlzheimer'sorvasculardementia be prevented with control of vascular risk factors[J].W V Med J，2011，107（3）：20-25.

[3]Black SE.Vascular cognitive impairment：epidemiology，subtypes，diagnosis and management[J].J R Coll Physicians Edinb，2011，41（1）：49-56.

[4]趙濤，王一民，劉娜，等.腦心通膠囊的立方之法探析[J].世界中西藥結合雜志，2012，7（11）：994-995.

[5]Maki T，Ihara M，Fujita Y，et al.Angiogenic and vasoprotective effects of adrenomedullin on prevention of cognitive decline after chronic cerebral hypoperfusion in mice[J].Stroke，2011，4（42）：1122-1128.

[6]Dong YF，Kataoka K，Toyama K，et al.Attenuation of brain damage and cognitive impairment by direct renin inhibition in mice with chronic cerebral hypoperfusion[J].Hyper-tension，2011，10（58）：635-642.

[7]Oades R，Taghzouti K，Simon H，et al.Dopamine-sensitive alternation and collateral behavior in a Y-maze：effects of d-amphetamine and haloperidol[J].Psychopharmacology（Berl），1985，85（1）：123-128.

[8]Hermann GE，Viard E，Rogers RC.Hindbrain glucoprivation effects on gastric vagal reflex circuits and gastric motility in the rat are suppressed by the astrocyte inhibitor fluorocitrate[J].J Neurosci，2014，34（32）：10488-10496.

[9]Jana c B，Radenovi c L，Selakovi c V，et al.Time course of motor behavior changes in Mongolian gerbils submitted to different durations of cerebral ischemia [J].Behav Brain Res，2006，175（2）：362-373.

[10]Li H，Park JH，Yan B，et al.Neuroprotection of alpinia katsumadai seed extract against neuronal damage in the ischemic gerbil hippocampus is linked to altered brainderived neurotrophic factor[J].Lab Anim Res，2011，27（1）：67-71.

[11]胡琴，陳春花，楊曉梅，等.養血清腦顆粒對蒙古沙鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1區神經元的治療作用[J].解剖學報，2007，38（5）：520-523.

[12]關莉，劉微，閆福曼，等.補陽還五湯對全腦缺血再灌大鼠皮層神經元NR1的影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2014，16（2）：22-24.

[13]Yatomi Y，Tanaka R，Shimada Y，et al.Type 2 diabetes reduces the proliferation and survival of oligodendrocyte progenitor cells in ischemic white matter lesions[J].Neuroscience，2014，12（54）：214-223.

[14]盧惠嫻，黎艷，莫新.輕度血管性認知障礙患者血清同型半胱氨酸超敏C反應蛋白與頸動脈狹窄的關系[J].齊齊哈爾醫學院學報，2014，35（12）：171-172.

[15]薛婧，徐江濤，李景春，等.腦心通對急性低壓低氧小鼠空間記憶功能及腦水腫的影響[J].現代生物學進展，2010，5（10）：869-871.

[16]曹巖巖，孟凌新，趙柏松，等.Tempol預處理對大鼠心肺復蘇后腦內HIF-1α及VEGF變化的影響[J].廣東醫學，2014，35（4）：497-500.

[17]蘇晗，張潔.Tempol預處理對七氟醚麻醉下老齡大鼠術后認知功能的影響[J].陜西醫學雜志，2015，44（2）：153-155.

[18]Fujita Y，Ihara M，Ushiki T，et al.Early protective effect of bone marrow mononuclear cells against ischemic white matter damage through augmentation of cerebral blood flow[J].Stroke，2010，4（1）：2938-2943.

[19]常玉林，于麗麗，楊強.七氟醚預處理對老齡大鼠術后認知功能障礙的影響及海馬區炎性細胞因子含量在其中的作用[J].中國醫藥指南，2015，13（9）：1-3.

[20]丘敏，曾維勇，劉微，等.補陽還五湯對腦缺血再灌注后星形膠質細胞connexin43影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2015，7（5）：36-38.

[21]李春桃，韓言秀，杜曉薇，等.三七三醇皂苷對糖尿病大鼠學習記憶能力及星形膠質細胞活性的影響[J].天津醫藥，2015，43（4）：364-366.

[22]張利軍，白宇，侯育青.三七三醇皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠微管相關蛋白2、膠質纖維酸性蛋白表達的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（3）：747-748.

[23]苗蘭，曹進，徐立，等.維腦康干預大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的蛋白質組學研究[J].世界中醫藥，2013，8（10）：1137-1141，1146.

[24]趙見文，田軍彪，張顏偉，等.化濁解毒活血通絡方對腦缺血再灌注損傷小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響[J].世界中醫藥，2012，7（1）：70-71.

[25]樊凱芳，李曉亮，梁曉東，等.三化湯對大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（7）：181-184.

[26]路雪雅，胡京紅.復方人參健腦液對大鼠缺血再灌注腦細胞損傷的作用[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（17）：208-211.

[27]洪妙玲，黃偉青，劉佩儀，等.DADLE對大鼠急性全腦缺血再灌注后海馬區神經元ERK信號通路和Caspase-3 表達的影響[J].中國醫學創新，2013，10（2）：7-9.

[28]任巖，曹余恒，李杰萍，等.補陽還五湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡和Caspase-3基因表達的影響[J].中國醫學創新，2014，11（13）：16-18.