口服頭孢菌素類藥物對肺炎鏈球菌肺炎大鼠腸道菌群的影響

尹 梅 劉振國 孟靜茹 侯 征 馬 雪

1.西安市兒童醫院特需科，陜西西安 710003；2.西北婦女兒童醫院藥劑科，陜西西安 710061；3.第四軍醫大學藥理學教研室，陜西西安 710032

肺炎鏈球菌是兒童社區獲得性感染的重要病原菌[1]，也是引起兒童呼吸道感染的常見致病菌，還可導致兒童中耳炎、鼻竇炎、腦膜炎、菌血癥及敗血癥等，具有很高的感染率和病死率[2]。根據WHO數據顯示，全球每年約160萬人死于肺炎鏈球菌感染，其中5歲以下兒童達100萬，90%以上死亡病例在發展中國家[3]。青霉素是肺炎鏈球菌感染的首選治療藥物，廣泛應用于肺炎鏈球菌感染的治療，但近年來耐藥情況日趨嚴峻[4]。目前，兒科臨床上常用口服頭孢菌素治療肺炎鏈球菌感染，但部分研究者認為在應用抗菌藥物治療過程中會干擾腸道菌群的定植，抑制機體益生菌，導致少數條件致病菌的易位和耐藥性的產生[5-6]。本實驗通過建立肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型，研究臨床常用口服頭孢菌素（頭孢克洛、頭孢地尼和頭孢克肟）對感染大鼠腸道菌群的影響，進一步探討其對某些細菌的耐藥性，為兒科臨床實踐中合理應用抗生素提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，50只，體重250～300 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（軍）2012-006。飼養環境：溫度（23.0±2.0）℃，濕度（55±5）%，光照 7∶00～19∶00。動物進行適應性訓練1周后使用。

1.2 菌株及藥品

1.2.1 致病菌株 選取西安市兒童醫院2014年2～4月住院22～26個月患兒咽拭子標本，經培養鑒定篩選獲得肺炎鏈球菌（編號：SP14021a）。將分離獲得的臨床菌株SP14021a在感染動物前接種于Muller-Hinton瓊脂（MHA）平板中，37℃過夜培養，轉接于MH肉湯培養基，37℃孵育至對數生長期，即為實驗所用菌液。將細菌原液離心（12000 r/min離心2 min）后，用無菌生理鹽水重懸稀釋后配制成細菌混懸液，用比濁儀調節混懸液的最終濃度為1.5×109備用。

1.2.2 藥品與試劑 頭孢克洛干混懸劑（希刻勞，0.125g/袋，禮來蘇州制藥有限公司，批號C354375），頭孢地尼分散片（達力先，0.1 g/片，深圳致君制藥有限公司，批號A140203），頭孢克肟顆粒（達力芬，50 mg/包，深圳致君制藥有限公司，批號A20131016），由西北婦女兒童醫院藥劑科提供。

1.3 動物分組

50只大鼠隨機分為5組，每組10只，隨機選取一組作為正常對照組，其余四組復制肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型，造模成功后再隨機分為感染后未治療組、頭孢克洛組、頭孢地尼組和頭孢克肟組，各組給藥劑量均根據人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表換算，分別采用灌胃方法給予頭孢克洛（100 mg/kg）、頭孢地尼（30 mg/kg）和頭孢克肟（45 mg/kg），正常對照組和肺炎鏈球菌肺炎模型組分別給予生理鹽水灌胃，每日2次，連續給藥5 d。

1.4 復制動物模型

采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，參照文獻[7]方法，將大鼠麻醉后仰臥固定于實驗臺，撐開大鼠口腔，充分暴露咽喉部，用連接注射器的鈍圓針頭經口緩慢插入氣管，通過微量注射器緩慢注入菌液40 μL（細菌濃度 5×108cfu/mL），使菌液直接進入大鼠肺內。正常對照組在同一時間用同樣方法注入等量的無菌生理鹽水。

1.5 糞便涂片

治療結束后留取各組大鼠糞便標本進行快速薄層涂片、固定，采用改良革蘭染色后鏡檢，每張涂片分別計數3個隨機油鏡視野下的革蘭陽性桿菌（G+桿菌）、革蘭陰性桿菌（G-桿菌）、革蘭陽性球菌（G+球菌）、革蘭陰性球菌（G-球菌）數量，計算百分比。

1.6 腸道菌群分析

各組動物處理后24 h麻醉取材。大鼠麻醉后仰臥固定于手術臺上，腹部脫毛后常規消毒皮膚，無菌條件下打開腹腔，切開大腸腸壁，取內容物約0.5 g，加生理鹽水10倍稀釋作為原液，取原液進行1∶10、1∶100、1∶1000 倍比稀釋， 分別取 100 μL 稀釋液用玻璃涂布棒均勻涂布于不同菌群的培養平板中，包括血瓊脂平板、麥康凱平板、腸球菌平板和念珠菌顯色平板。血瓊脂平板主要用于培養腸道彎曲菌、幽門螺桿菌等，麥康凱平板主要用于培養革蘭陰性腸道桿菌，腸球菌平板主要用于培養腸球菌，念珠菌顯色平板主要用于真菌培養。各標本每個濃度的稀釋液分別做3個平板，置于37℃CO2培養箱中培養，其中血瓊脂平板、麥康凱平板、腸球菌平板培養24 h，選擇性培養腸桿菌及腸球菌；乳酸桿菌選擇培養基MRS平板、念珠菌顯色平板培養48 h，選擇性培養乳酸桿菌及念珠菌。統計各平板菌落數并計算各梯度的菌落平均數。根據下列公式進行細菌定量分析：組織細菌含量[cfu/g（mL）]=菌落數×稀釋倍數/組織重量。各類細菌根據革蘭染色和菌落形態進行初步鑒定，再由細菌自動分析儀進行菌落鑒定。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 頭孢菌素對肺炎鏈球菌感染大鼠腸道菌群比例的影響

與正常對照組相比，感染后未治療組中G+桿菌和G-球菌占腸道細菌總數比例明顯降低（P<0.01或P<0.05），G-桿菌及G+球菌占細菌總數比例明顯升高（P<0.01或P<0.05）。與正常對照組相比，應用三種頭孢菌素類藥物治療后G+桿菌比例均明顯降低 （P<0.01 或 P<0.05），G-桿菌比例明顯升高（P<0.05），G-球菌比例無顯著性變化。與正常對照組相比，應用頭孢克洛可導致G+球菌比例明顯升高（P<0.05），但應用頭孢地尼和頭孢克肟后G+球菌比例未見顯著性變化（P>0.05）。與感染后未治療組相比，應用頭孢克洛治療5 d后腸道內G-桿菌比例雖下降，但差異無統計學意義 （P>0.05），G-球菌占細菌總數比例明顯升高（P<0.05），其余腸道細菌比例無顯著性變化。與感染后未治療組相比，應用頭孢地尼治療5 d后腸道內G+球菌比例下降，G-球菌比例升高（P<0.05）。與感染后未治療組相比，應用頭孢克肟治療5 d后腸道內G+桿菌占細菌總數比例升高 （P<0.05），G-桿菌和G+球菌比例降低（P<0.05）。見表1。

表1 頭孢菌素對腸道各菌群數占總菌群數比例的影響（%， ±s）

表1 頭孢菌素對腸道各菌群數占總菌群數比例的影響（%， ±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與未治療組比較，#P<0.05

58.72±4.22 33.38±3.73**35.28±4.06**41.55±2.18**45.63±3.54*#35.14±1.85 58.07±4.27**55.66±4.14*50.23±3.95*48.14±4.32*#5.08±1.06 8.02±2.73*7.95±2.15*6.40±1.08#5.38±1.24#1.06±0.23 0.53±0.11*1.11±0.33#1.82±0.52#0.85±0.46 G+桿菌 G-桿菌 G+球菌 G-球菌正常對照組未治療組頭孢克洛頭孢地尼頭孢克肟10 10 10 10 10組別 只數

2.2 頭孢菌素對肺炎鏈球菌感染大鼠腸道菌群數量的影響

將計數所得細菌數量進行對數轉換后統計比較，結果顯示，與正常對照組相比，在肺炎鏈球菌感染后未治療組中腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌數量均明顯升高（P<0.05），念珠菌數量雖輕微升高，但差異無統計學意義（P>0.05）。與正常對照組相比，應用頭孢克洛、頭孢地尼治療5 d后，腸球菌數量均顯著升高（P<0.01）。與正常對照組相比，應用頭孢克肟治療后腸球菌數量雖輕微升高，但差異無統計學意義（P>0.05）；與感染后未治療組相比，應用頭孢克肟治療后腸球菌數量明顯減少（P<0.05）。與肺炎鏈球菌感染后未治療組相比，應用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，雙歧桿菌和乳酸桿菌數量均顯著減少（P<0.05）。與正常對照組和肺炎鏈球菌感染后未治療組相比，三種頭孢菌素均導致腸道內念珠菌數量顯著增多 （P<0.05）。 見表 2。

表2 頭孢菌素對4種類型腸道菌群數量的影響（logcfu/g， ±s）

表2 頭孢菌素對4種類型腸道菌群數量的影響（logcfu/g， ±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與未治療組比較，#P<0.05

正常對照組未治療組頭孢克洛頭孢地尼頭孢克肟10 10 10 10 10 6.79±0.75 8.47±0.67*9.26±0.14**9.68±0.41**7.89±0.53#7.38±0.56 9.35±0.63*6.85±0.95#7.70±1.08#7.86±1.14#6.98±0.46 8.92±0.73*6.85±0.95#7.40±1.08#7.26±1.14#5.46±0.38 5.95±0.74 6.76±0.58*#6.42±0.42*#6.85±0.46*#組別 只數 腸球菌 雙歧桿菌 乳酸桿菌 念珠菌

2.3 頭孢菌素對肺炎鏈球菌感染大鼠腸道菌群種類的影響

將各類細菌的檢出情況以被檢樣品總例數中陽性出現的只數表示。在正常對照組各樣本中均檢出大腸埃希菌和糞腸球菌，未見肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌和屎腸球菌。在肺炎鏈球菌感染后未治療組中，10只中有2只新檢出肺炎克雷伯桿菌，1只新檢出變形桿菌，但腸道內優勢菌仍是大腸埃希菌和糞腸球菌，在各樣本中均可檢出。與感染后未治療組相比，應用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，大腸埃希菌的檢出例數分別為8、7、8只，檢出率分別降低至80%、70%、80%，可見三種不同頭孢菌素類藥物對大腸埃希菌均有抑制作用；糞腸球菌檢出率也表現出不同程度的降低，其中頭孢地尼治療后糞腸球菌檢出率下降最為顯著，由100%降低至50%，僅5只檢出糞腸球菌。與感染后未治療組相比，應用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，肺炎克雷伯桿菌仍在少數樣本（1～2只）中可檢出，但變形桿菌的檢出率升高，檢出例數分別為3、4、2只。與感染后未治療組相比，應用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟治療5 d后，銅綠假單胞菌的檢出只數分別為4、3、3只，屎腸球菌的檢出只數分別為2、3、2只，可見三種不同頭孢菌素藥物均可導致銅綠假單胞菌和屎腸球菌檢出率升高。見表3。

表3 頭孢菌素對腸道菌群各類細菌檢出情況的影響（只）

3 討論

抗生素的研發和應用使感染相關性疾病的死亡率明顯降低，但隨著廣譜抗生素的廣泛應用，也導致細菌對抗生素的耐藥性日益嚴重，誘導和選擇作用引起的細菌耐藥問題日益嚴峻，己成為全球性公共衛生問題[8-10]。腸道菌群是腸道內環境的重要組成部分，通過與宿主之間的相互作用而調控腸道穩態，具有重要的免疫調節、內分泌和代謝等功能。研究表明，腸道菌群失調會擾亂宿主正常的生理平衡[11]，從而引起包括慢性感染、炎癥、腫瘤、肥胖、糖尿病、心血管疾病、神經系統疾病、過敏性疾病等在內的多種疾病[12-13]。研究發現，廣譜抗生素的應用將導致腸道內微生態環境失調，在廣譜抗生素壓力下腸道微生態屏障破壞，不僅使外源性條件致病菌發生腸道定植，還可能誘導腸道原籍條件致病菌引發腸源性感染，因此目前認為廣譜抗生素的濫用可能是導致腸道菌群失調、細菌易位及產生細菌耐藥菌的重要原因[4-6]。

肺炎鏈球菌是兒童社區獲得性感染的重要病原菌，也是引起兒童呼吸道感染的常見致病菌，主要累及5歲以下兒童[14]。臨床上常用口服頭孢菌素治療兒童肺炎鏈球菌感染。臨床研究數據顯示，頭孢菌素類藥物的使用對人體腸道菌群的數量及結構影響明顯[15-16]。此外，嬰幼兒期是腸道菌群發展的重要時期，過早應用廣譜抗生素會干擾嬰幼兒正常腸道菌群的定植，破壞早期建立的菌群平衡，更容易導致少數條件致病菌的易位和耐藥性的產生，年齡越小影響越明顯[17]。研究也發現，在嬰兒期使用廣譜抗生素會導致過敏性疾病發病率的升高，兒童過敏性疾病的高發與腸道菌群失衡有關，其原因是抗生素應用引起腸道微生物群發生改變，過敏兒童腸道中大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌數量增多而乳酸桿菌和雙歧桿菌數量顯著減少[18-19]。因此，探討兒童常用的頭孢菌素類藥物在兒童常見感染性疾病的治療過程中對腸道菌群數量和結構的影響對臨床合理用藥具有重要的指導意義。

在本研究中仍采用了傳統的分離檢測方法，通過采集模型大鼠糞便和腸道內容物，進行涂片觀察和細菌培養計數。涂片法測定糞便中球菌與桿菌的數量是反映腸道菌群平衡的一個基礎指標。在健康成年人糞便中，桿菌明顯多于球菌，其中G+桿菌占50%～60%，G-桿菌占 40%～50%，G+球菌占 5%～15%，G-球菌占3%～10%。在肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型上，連續5 d應用頭孢克洛、頭孢地尼或頭孢克肟，可以對腸道菌群中球菌和桿菌的比例產生不同程度的影響，表明頭孢菌素類藥物的使用可以影響腸道菌群的數量及結構。人體內正常腸道菌群包括需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌，其中，厭氧菌占絕對優勢。腸道內乳酸桿菌、雙歧桿菌等專性厭氧菌定植于腸黏膜上皮表面，是機體的生理性益生菌，具有多種微生物拮抗功能，對腸道內兼性厭氧菌和需氧菌等條件致病菌起抑制或殺滅作用，對維持腸道的微生態平衡起重要作用。在多種疾病狀態或應用抗生素的情況下，腸道益生菌減少，腸道需氧菌、兼性需氧菌大量增殖，成為優勢菌群，導致菌群失調。因腸道菌群所包含的菌種及數量復雜多樣，在本研究中選取了腸道常見兼性需氧桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌及真菌作為觀察對象。研究表明，在肺炎鏈球菌感染大鼠肺炎模型上，連續5 d應用頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢克肟均可導致腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數量顯著減少，腸球菌和念珠菌數量增多，繼而可能引起菌群失調，使腸道微生態環境失衡[19]。既往研究發現，長期使用頭孢曲松可能會導致耐藥菌和條件致病菌產生，并取代有益菌成為優勢菌群[15，20]。本實驗中對腸道兼性需氧桿菌、腸球菌、真菌種類變化的研究結果表明，正常對照組大鼠腸道內容物兼性需氧桿菌中以大腸埃希菌占絕對優勢，腸球菌以糞腸球菌占絕對優勢，其他條件致病菌因數量低于檢測靈敏度而常規平板培養方法不能檢出，但應用頭孢菌素類藥物后，可不同程度出現肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌及銅綠假單胞菌等條件致病菌，這可能與乳酸桿菌數量減少導致對其定植抗力減弱有關。此現象在一定程度上也說明，社區獲得性感染常見的病原菌銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌等部分可能是腸源性的，腸道菌群對于社區獲得性感染的防治具有重要的臨床意義。

綜上所述，口服頭孢菌素類藥物也可能破壞腸道微生態環境，引發其他的病理生理過程。在兒科臨床應用過程中，應針對不同適應證合理應用抗生素，同時必須嚴格控制抗生素應用時間的長短，避免導致腸道菌群紊亂而引發過敏及免疫功能下降等問題。在必須使用抗生素時，應盡可能維持微生態平衡，可以考慮適當補充益生菌，預防和減少菌群失調所產生的不良影響。

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