多重調理吞噬試驗方法的重復性和再現性研究

李江姣 杜慧竟 石繼春 陳翠萍 徐 苗 葉 強

中國食品藥品檢定研究院 衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 100050

肺炎球菌疫苗的保護力可以通過臨床效力試驗來確定[1]，但由于需要的樣本量大、費用高、周期長等原因臨床效力試驗往往不易實施。建立與肺炎球菌疫苗保護力相關聯的實驗室檢測手段，使用血清學檢測結果作為觀察終點，能夠協助疫苗效力試驗評估肺炎球菌疫苗的保護力，大大縮短周期。通過酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進行的莢膜多糖特異性IgG抗體的定量測定，是目前比較成熟的在嬰幼兒新型肺炎球菌疫苗審批中使用的臨床效力評價方法[2]。而由于成人存在交叉反應抗體，用ELISA法檢測的IgG抗體特異性較低[3]，因此人們試圖尋找特異性高并與疫苗保護力相關性更高的替代試驗。

相比ELISA方法，體外調理吞噬試驗（Opsonop-hagocytic assay，OPA）可以反映機體抵御肺炎球菌感染的體內機制[4-5]，其結果能更加真實地反映肺炎球菌疫苗的保護效力[6-7]，因此OPA技術在國際疫苗監管體系中受到越來越多的重視，并得到了不斷的發展和優化。隨著OPA技術的發展，一些實驗室改用HL-60細胞作為效應細胞，代替外周血淋巴細胞，并對試劑和試驗步驟進行優化。在此基礎上，美國阿拉巴馬大學肺炎鏈球菌血清學參比實驗室研發的多重調理吞噬實驗技術（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA）能夠同時進行4個血清型的功能抗體檢測，極大提高了多價疫苗的檢測效率，促進了該項技術的推廣應用[8]。然而由于操作相對復雜，技術要求高，我國長期以來對該方法的研究和應用均較缺乏。為了提升我國藥檢機構對肺炎球菌疫苗的免疫效果評價水平，本研究組前期已經成功建立起MOPA技術[9]，利用該技術對13價肺炎球菌結合疫苗免疫后的12份嬰兒血清樣本進行了OPA滴度檢測，并與相應的ELISA結果進行了比較分析，結果顯示，OPA法與ELISA法測定的血清抗體效價的相關性較高，二者結果具有良好的一致性[10]。

為了進一步對所建立的MOPA技術進行驗證，本研究在兩個不同實驗室[中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱“我院”）及該技術的發明單位美國阿拉巴馬大學肺炎球菌血清學參比實驗室]利用MOPA技術對同一組血清樣本（19份血清）針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度分別進行了兩輪MOPA檢測，并對兩實驗室間結果及我院內的兩輪結果進行了比較分析，旨在通過與國際參比實驗室的比較來檢驗我們建立的MOPA方法的重復性（我院內比較）和再現性（兩個實驗室間比較），進而為我國藥檢機構應用該技術進行肺炎球菌疫苗免疫效力評價的可靠性提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HL-60 細胞系購自美國 ATCC（CCL-240）；13 種血清型的肺炎鏈球菌靶菌、19份血清樣本、以及乳兔補體來源于美國阿拉巴馬大學肺炎鏈球菌血清學參比實驗室。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 我院使用的試劑及儀器 二甲基甲酰胺（DMF）（批號：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（批號：2532B313）、鏈霉素（Streptomycin，批號：2036B318）購自美國梭倫Amresco公司；奧普脫欣（Optochin，批號：051M1257V）、奇 霉 素 （Spectinomycin， 批 號 ：102K05 447V）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，批號：BCBC9232V）購于美國圣路易斯Sigma公司；菌落計數器 （型號：ProtoCOL 3）購自英國劍橋Synbiosis公司。

1.2.2 美國阿拉巴馬大學肺炎鏈球菌血清學參比實驗室使用的試劑及儀器 DMF（批號：107575）購自美國匹茲堡 Fisher Scientific公司；TTC（批號：BCBP3272V）、鏈霉素（Streptomycin，批號：SLBH9702V）、奧普脫欣（Optochin，批號：051M1269V）、奇霉素（Spectinomycin，批號：102K05782V）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，批號：BCBN2518V）購于美國圣路易斯Sigma公司；菌落計數器（型號：ProtoCOL 3）購自英國劍橋Synbiosis公司。

1.3 OPA滴度檢測

OPA滴度檢測采用可同時檢測4種血清型的多重調理吞噬實驗方法（MOPA法）。具體操作步驟見參考文獻[9-10]。我院及美國阿拉巴馬大學肺炎鏈球菌血清學參比實驗室對19份血清樣本的13個血清型分別進行兩輪MOPA檢測，每輪MOPA試驗中的每個血清樣本均平行測定2次，取平均值作為每輪試驗的結果值。

1.4 結果分析

進行兩實驗室間的結果比較時，取各自實驗室兩輪MOPA試驗結果的平均值作為各自實驗室的最終結果值。將OPA滴度值轉換為以10為底的對數，進行線性回歸分析，計算相關系數。

2 結果

19份血清樣本針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度在兩實驗室間及我院內的比較結果見圖1（封三）。圖1可以看出，兩實驗室間比較及我院內比較產生的點均大部分集中聚集在一致線上及其附近，提示結果有著良好一致性。實驗室間比較的點相較與實驗室內比較的點分布稍微分散。19份血清樣本針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度在兩實驗室間及本室兩輪試驗的相關系數統計結果具體見表1。

3 討論

特異性抗體、補體與吞噬細胞表面結合，促進吞噬細胞吞噬細菌等顆粒性抗原的過程稱為調理吞噬作用，是人類宿主抵抗肺炎球菌感染的主要機制[4]。由于OPA技術可以直接測定具有調理吞噬功能的功能性抗體水平[5]，并且與肺炎球菌疫苗免疫保護效力的相關性比ELISA法更高[6-7]，因而OPA技術在國際上受到越來越多的關注和應用[11-15]。2013年美國惠氏公司的13價肺炎球菌結合疫苗在歐洲被批準用于50歲以上成人使用時，采用OPA技術進行臨床效果評價[16-17]。2015年美國默沙東公司新注冊的的15價肺炎球菌結合疫苗使用OPA法進行臨床評價[18]。

表1 MOPA實驗比較結果的相關系數

然而，由于OPA試驗操作相對復雜，對實驗室條件及操作人員專業技術要求高，因而其大范圍的推廣應用受到了一定程度限制。OPA試驗中涉及的活性物質較多，需要經過反復摸索逐漸掌握。首先，效應細胞是OPA實驗中一個重要部分，也是比較難于掌控的一個環節。許多實驗室在建立OPA技術時遇到的主要障礙來自HL-60細胞的操作。因為該方法不僅要求實驗室具備細胞培養能力，還得確保HL-60細胞能夠有效分化為中性粒細胞樣吞噬細胞。誘導劑DMF的濃度、細胞分化時間以及用于分化的細胞數量都需嚴格控制。其次，該方法中各血清型的活性靶菌數均需控制在70～180 cfu范圍內以保證計數數據的準確性，而實驗中各種原因常常導致靶菌數量波動和超出范圍，容易導致試驗失敗。再次，本方法對補體的要求也比較高，要求補體自身的非特異性殺菌力不能太強，需經過篩選。正由于該方法試驗操作復雜，技術性要求高，目前在國內的發展和應用仍比較缺乏。為了促進該技術在國內的應用，我院前期構建了該技術所需的HL-60主代細胞庫、13種血清型的工作菌種批，完成了相應的有效性檢測，最終成功建立起MOPA技術[9]。隨后利用建立的MOPA技術完成了12份血清樣本的13種血清型的OPA滴度檢測，并與相應的ELISA結果進行了比較分析，得到較高的一致性結果[10]。

為了進一步對所建立的MOPA技術進行驗證，本研究組利用MOPA技術對19份血清樣本針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度在兩個實驗室（我院和美國阿拉巴馬大學MOPA技術發明實驗室）分別進行了兩輪檢測，并對兩實驗室間結果及我院內兩輪結果進行比較分析，通過與國際權威參比實驗室的結果比較來檢驗建立的MOPA技術的再現性和重復性。本研究結果顯示：全部13個血清型的總的實驗室間和總的實驗室內相關系數均較高，分別為0.94和0.96。各血清型的實驗室間和實驗室內相關系數范圍分別為0.87～0.99 和 0.68～0.99。 1、3、5、6A、6B 型在兩實驗室間測定的OPA滴度相關性很高，其中1、5型的兩實驗室間相關性最高，均為0.99。4型和9V型在兩實驗室間相關性相對略低，分別為0.87和0.88。9V型在我院內兩次OPA結果相關系數偏低，可能是由于兩次實驗中所用效應細胞的分化狀態不同導致?？傮w上看，13個血清型的總實驗室內相關系數高于總實驗室間相關系數；各血清型分開來看，多個型別的實驗室內相關系數小于實驗室間相關系數，可能由于兩實驗室間進行比較的數值是各自實驗室兩輪OPA試驗的平均值，結果值更為準確一些。國際上有過6個實驗室同時用OPA法檢測16份血清樣本的研究，得出實驗室間相關系數范圍為0.71～0.91[19]。本研究證實我院建立的MOPA方法具有良好的重復性和再現性，不低于國際同等水平。

綜上所述，本研究證明所建立的MOPA方法具有良好的重復性和再現性。未來還將對建立的MOPA方法做更多的驗證，如特異性、精密性等，以逐步完善該方法的整體驗證，最終為該技術成功應用于肺炎球菌疫苗的臨床免疫效果評價，并為實現在我國藥檢機構的推廣提供基礎。

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