蛇足石杉形態解剖學與組織化學定位研究*

盧婧瑋1，陳沈超1，馮曉燕1，周江俊1，張曉丹2，祁哲晨2，侯卓妮2，呂洪飛1,2

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004;2.浙江理工大學 生命科學學院,浙江 杭州 310018)

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蛇足石杉形態解剖學與組織化學定位研究*

盧婧瑋1，陳沈超1，馮曉燕1，周江俊1，張曉丹2，祁哲晨2，侯卓妮2，呂洪飛1,2

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004;2.浙江理工大學 生命科學學院,浙江 杭州 310018)

采用石蠟切片法，對蛇足石杉的不同器官進行了解剖學特征研究；結合冰凍切片法，用碘化鉍鉀、氯化鐵染色法分別對蛇足石杉的根、莖和葉中的生物堿和黃酮類化合物進行了組織化學定位.結果表明：生物堿主要存在于蛇足石杉根和莖的中柱木質部和皮層的薄壁細胞中，少數存在于葉肉細胞及其胞間隙中，其含量大小順序為：莖≈根>葉；黃酮類化合物主要存在于蛇足石杉的小型葉肉細胞及其胞間隙中，部分存在于根和莖的中柱韌皮部，含量大小順序為：葉>莖≈根；在不同的器官中，生物堿和黃酮類化合物的含量存在差異，其中莖和根的生物堿含量較高，而葉中黃酮類化合物含量較高.

蛇足石杉；形態解剖；組織化學定位；生物堿；黃酮類化合物

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.) Trev.)屬石杉科石杉屬，又名蛇足草、金不換、萬年杉等，植株小型，為多年生草本蕨類植物，分布廣泛.蛇足石杉是一種珍貴的藥用植物，民間用于治療瘀血腫痛、內傷吐血、解毒止痛等[1].藥理實驗證明，蛇足石杉所含生物堿具有膽堿酯酶抑制作用，對肌肉有舒張和收縮作用，可提高學習記憶能力和改善記憶障礙；另外，臨床研究表明石杉堿甲對于治療老年性癡呆具有良好效果[1-4].有研究表明蛇足石杉中含有黃酮類化合物[5]，并有學者對其提取工藝進行了優化[6].近年來，黃酮類化合物因其具有重要的抗氧化、抗衰老和抗病毒等作用而受到廣泛關注.藥理實驗表明,適量攝入黃酮類化合物能減少癌癥、腫瘤、心血管疾病、脂質過氧化及骨質疏松等疾病的發病率[7].

由于蛇足石杉所含化學成分的藥用價值逐漸被發現，人們越來越意識到蛇足石杉可以作為一種新藥資源來開發利用.目前已有學者對蛇足石杉所含生物堿成分的提取與含量測定進行了相關研究[7-10].但是，關于總生物堿及黃酮類化合物在蛇足石杉不同部位中的分布規律，至今未見詳細報道.作為一種與生物堿反應顯色的試劑，Dragendorff試劑(碘化鉍鉀試劑)被廣泛用于各類生物堿的鑒定[11-12]，而改良的碘化鉍鉀試劑可以更好地用于生物堿的鑒定和測定[13-16].本實驗通過對蛇足石杉的形態解剖學研究，以及用改良的碘化鉍鉀法和5%氯化鐵法分別對蛇足石杉中的生物堿和黃酮類化合物進行了定位研究，旨在闡明生物堿和黃酮類化合物在蛇足石杉不同器官中的分布，以期為其藥材真偽鑒別、藥物資源的開發利用及蛇足石杉的組織培養和科學栽培管理等提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料

蛇足石杉全草采自浙江省金華市北山，經呂洪飛教授鑒定后栽培于浙江師范大學化學與生命科學學院的實驗園地.

1.2 形態解剖學研究

用于結構觀察的新鮮材料，經FAA固定液(V(福爾馬林)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=5∶5∶90)固定，采用石蠟切片技術，切片厚度為10 μm，粘片、展片后采用番紅-固綠對染，于Olympus BX 50光學顯微鏡下觀察、攝影.

1.3 組織化學定位

用于組織化學定位研究的材料為新鮮的根、莖和葉，采用冰凍切片技術，切片厚度為10～12 μm，生物堿和黃酮類化合物分別經改良的碘化鉍鉀試劑[12]、5%氯化鐵試劑染色，于Olympus BX 50光學顯微鏡下觀察、攝影.

定性測定蛇足石杉的根、莖、葉中生物堿和黃酮類化合物的分布密度和顆粒大小：取不連續的冰凍切片比較觀察，根據著色顆粒的分布密度和大小劃分5個等級：+++++級，顆粒分布密度大、顆粒大；++++級，顆粒分布密度中等、顆粒大，或顆粒的分布密度大、顆粒大小中等；+++級，顆粒分布密度中等、顆粒大小中等，或顆粒分布密度大、顆粒小，或顆粒分布密度稀少、顆粒大；++級，顆粒分布密度稀少、顆粒大小中等；+級，顆粒分布密度稀少、顆粒小或無.

2 結果與分析

2.1 蛇足石杉的內部結構

2.1.1 根的石蠟切片

圖1(a)和(b)為蛇足石杉根的石蠟切片，其橫切面呈近圓形，由外至內為表皮、皮層和中柱.表皮細胞為1列輕微栓化的方形薄壁細胞，排列整齊且緊密.外皮層細胞為2～3列排列整齊、緊密的長方形薄壁細胞；中皮層由5～7列厚壁細胞組成，排列緊密，偶有細胞間隙；內皮層為3～5列薄壁細胞，排列緊密，無細胞間隙.維管柱為原生中柱，中柱鞘為1列長方形薄壁細胞，排列緊密.

2.1.2 莖的石蠟切片

圖1(c)和(d)為蛇足石杉莖的石蠟切片，其橫切面呈近圓形，分為表皮、皮層和中柱.表皮由1～3列長方形薄壁細胞組成，排列整齊緊密.表皮外附著有木栓化的死細胞殘余.皮層發達，由外皮層、中皮層和內皮層構成：外皮層是厚壁細胞，排列緊密，無細胞間隙；中皮層為薄壁細胞，排列疏松，有較大的細胞間隙；內皮層明顯，由1列薄壁細胞組成，排列緊密，無細胞間隙.中央有維管柱，維管柱的木質部向四周生長出輻射排列的倒三角形的脊狀突起，形成星狀中柱.

2.1.3 葉的石蠟切片

蛇足石杉葉由表皮、葉肉和葉脈組成，表皮外包被一層角質層.葉的上、下表皮均為1列長方形薄壁細胞.橫切面觀葉肉細胞由不規則細胞組成，細胞間隙較大，分化不明顯(見圖1(e)).

2.2 蛇足石杉根、莖、葉的改良碘化鉍鉀反應

對蛇足石杉的根、莖、葉冰凍切片進行改良的碘化鉍鉀反應，結果表明：根的冰凍切片中，根中柱的木質部有大量橘紅色顆粒狀沉淀(如圖2中↑所示)，內外皮層之間的薄壁細胞中散見有橘紅色顆粒狀沉淀(見圖2(a)和(b))；莖的冰凍切片中，莖中柱的木質部有較多的橘紅色顆粒狀沉淀，內外皮層之間的薄壁細胞中散見有橘紅色顆粒狀沉淀(見圖2(c))；葉的冰凍切片中，葉肉細胞及胞間隙中可見細小的橘紅色沉淀(見圖2(d)和(e)).碘化鉍鉀染色顯示生物堿的分布及含量在蛇足石杉的不同器官存在差異(見表1).

2.3 蛇足石杉根、莖、葉的氯化鐵反應

對蛇足石杉的根、莖、葉冰凍切片進行氯化鐵反應，結果表明：根的冰凍切片中，根中柱的木質部被染成深綠色(見圖3(a)中↑所示)；莖的冰凍切片中，莖中柱的木質部被染成深綠色(見圖3(b))；葉的冰凍切片中，在小型葉肉細胞及胞間隙中觀察到大量的深綠色沉淀，其中胞間隙顏色較細胞壁淺(見圖3(c)和(d)).氯化鐵染色顯示,黃酮類化合物的分布及含量在蛇足石杉不同器官存在一定的差異(見表1).

3 討 論

3.1 蛇足石杉的形態解剖學特征

蛇足石杉的莖中皮層細胞排列疏松，有一定的細胞間隙，便于儲存水分，反應莖結構對水分的適應性.研究發現，蛇足石杉莖的維管柱組織不發達，其木質部向四周生長出7個脊狀突起，形成星散狀.與黎有有等[17]對蛇足石杉莖木質部的觀察結果基本一致.周毅等[18]研究發現5個居群的蛇足石杉木質部多數是6個或7個脊，也有出現4，5或8個脊的；而魯潤龍等[19]認為蛇足石杉的木質部是由6個輻射排列的脊狀突起構成.這可能是由于蛇足石杉的木質部在不同的生態環境中存在著變異所致.

3.2 蛇足石杉的組織化學定位

根據對蛇足石杉的根、莖、葉所含生物堿進行組織化學定位可知，生物堿主要存在于蛇足石杉根和莖的中柱木質部和內外皮層之間的薄壁細胞中，含量大小順序為莖≈根>葉.杜次等[10]對湘西蛇足石杉的總生物堿進行了測定，發現石杉堿甲和乙的分布均為葉>莖>根，石杉堿丙的分布則是根>葉和莖；而孫遠明等[20]通過對不同產地蛇足石杉的不同部位所含石杉堿甲(Hup A)進行考察,并用RP-HPLC法檢測了Hup A的含量，發現Hup A含量在蛇足石杉地上部分>地下部分，且不同地區含量有差異.由于蛇足石杉中生物堿單體種類有20多個[21]，本實驗是對蛇足石杉根、莖、葉中生物堿總量進行組織化學定位，并沒有確定具體單體的含量及其分布情況，因此與前人的研究結果并不矛盾.

黃酮類化合物經氯化鐵反應后呈現出深綠色.蛇足石杉的根、莖、葉中黃酮類化合物的組織化學定位結果表明，蛇足石杉莖和根中柱韌皮部的總黃酮含量低于葉片中的，即黃酮類化合物以葉片中分布為主.這與魯翠濤等[22]利用分光光度計對蛇足石杉莖葉內的黃酮類物質進行測定的結果一致.同時，文獻[22]對千層塔葉片黃酮提取液進行各種定性顏色反應，初步判斷其中的黃酮類物質主要為黃酮類和黃酮醇類.本實驗中對蛇足石杉葉片所含黃酮類物質進行組織化學定位的顏色也有差異，可能是由于器官中含有不同的黃酮類物質引起的.

對蛇足石杉組織化學定位的研究結果表明，生物堿和黃酮類化合物的含量在蛇足石杉不同器官中存在差異.因此,可以根據不同的需要選擇合適的部位進行組織培養.

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(責任編輯 薛 榮)

AnatomicalstructureandhistochemicallocalizationofHuperziaserrata

LU Jingwei1, CHEN Shenchao1, FENG Xiaoyan1, ZHOU Jiangjun1,ZHANG Xiaodan2, QI Zhechen2, HOU Zhuoni2, Lü Hongfei1,2

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China; 2.SchoolofLifeSciences,ZhejiangSci-TechUniversity,HangzhouZhejiang310018,China)

The paraffin sections were used to study the characteristics of morphological and anatomic structure; an improved dragendorff reagents (bismuth potassium iodide reagent) was used to locate the alkaloid in root, stem and leaf ofHuperziaserrata; the ferric chloride reagent was used to locate the flavonoid in root, stem and leaf ofH.serrata. The results showed that the color reaction and special crystal deposition sites indicated that the alkaloid was located in the stele xylem and parenchyma of root and stem, and mesophyll and its intercellular space of leaf. The alkaloid content in stem was almost equal to that in root, which was in general higher than that in leaf. The flavonoid was located in mesophyll and its intercellular space of leaf, the stele phloem of root and stem. The flavonoid content in stem was almost equal to that in root, which was in general lower than that in leaf. The alkaloid and flavonoid contents were obviously different among the different organs of the same species. The highest alkaloid content was in the stem and root, and the highest flavonoid content was found in the leaf based on these observation. The value of this study resided not only in indicating that different organs having different medicinal value, but also in providing theoretical basis of tissue culture and cultivation and the selection of medicinal parts forH.serrata.

Huperziaserrata; morphological and anatomic structure; histochemical localization; alkaloid; flavonoids

10.16218/j.issn.1001-5051.2015.04.015

2015-03-16；

：2015-03-26

浙江省科技特派員團隊項目(2012T2T223)

盧婧瑋(1990-)，女，河南濮陽人，碩士研究生.研究方向：資源植物學.

呂洪飛.E-mail: luhongfei0164@163.com

R931.6

：A

：1001-5051(2015)04-0447-05