病原微生物檢測技術進展

張艷秋

病原微生物檢測技術進展

張艷秋

快速鑒定病原微生物的檢驗技術的更新?lián)Q代非常迅速，其主要原因在于微生物的生理特性，它們種類繁多且變異迅速。對病原體進行快速、準確的檢測是十分必要的。常規(guī)的檢測方法操作復雜，耗時長，且對操作人員的要求極高，已經遠遠不能滿足現(xiàn)在對各種病原體的診斷和流行病學研究，微生物檢測技術必須得到快速發(fā)展，才能適應未來發(fā)展的要求。

微生物；檢測技術；進展

病原學診斷已從病原體水平，深入到分子水平、基因水平，如PCR技術、基因芯片技術等。這些技術通過自動化完成檢測，耗時短，準確性和靈敏度都很高。這樣的現(xiàn)代生物科學技術能夠對病原微生物做出及時的診斷和鑒定，可大大減少人類對其感染的致病率和死亡率。本文對一些微生物檢測技術進行簡要介紹。

1　病原微生物檢測傳統(tǒng)方法

病原微生物傳統(tǒng)的實驗室檢查方法是將標本涂片染色后在顯微下進行鏡檢和采用在培養(yǎng)基上接種后進行分離培養(yǎng)。

1.1涂片鏡檢

由于傳統(tǒng)的鏡檢方法方便快捷，因此對于類似螺旋體感染、淋球菌感染、結核分枝桿菌等具有特殊形態(tài)病原微生物感染的初步診斷，實驗室里仍然將鏡檢方法作為重要檢測手段。

1.2分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)用于從檢驗標本或培養(yǎng)物的多種細菌中分離出某一種細菌的檢驗，但傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法存在著檢測周期較長且不能批量處理樣本的缺陷。隨著檢驗設備的技術性進步，目前生產出的自動培養(yǎng)和鑒定系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，較先進的全自動微生物分析儀，不但可以批量處理，而且可同時做細菌鑒定和藥敏試驗縮短了檢測周期。

2　酶聯(lián)免疫與免疫磁珠分離技術

2.1酶聯(lián)免疫

酶聯(lián)免疫測試技術是通過已知的抗體或抗原檢測病原體的抗原或抗體的一種血清學檢測技術，此技術可以對病原體進行快速鑒定。酶聯(lián)免疫技不但可以檢測樣本中病原體抗原，而且可以檢測機體的抗體成分，此技術的應用在很大程度上提升了血清學檢測的特異性和敏感性，全自動免疫分析儀就因其具有高靈敏度和耗用時間短的特點而受到重視。

2.2免疫磁珠分離技術

免疫磁珠分離技術（IMBS）是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯(lián)到磁珠微球上并通過抗原抗體反應形成磁珠，通過外部磁場磁力，將目標病原體分離出來的微生物檢測技術。作為微生物檢測領域中的一種新技術，IMBS在近年來得到了廣泛應用，目前已經開發(fā)出了針對各種病原體的免疫磁珠。免疫磁珠分離技術(IMBS)特點是不但減少檢測耗時，而且可提高檢測限。

3　基因檢測

由于病原微生物的核酸序列具有特異性，因此鑒別病原微生物可能過檢測其特有的基因片段序列來實現(xiàn)。

3.1核酸雜交技術

核酸原位雜交和膜上印跡雜交兩種技術主要應用在病原微生物檢測中。其中核酸原位雜交是直接與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，而膜上印跡雜交是標記的核酸探針與從微生物細胞中分離出來的核酸進行雜交，與其他方法比，核酸雜交種技術除了更加簡便快速外，在特異性和敏感性上也都較為突出。

3.2基因芯片技術

通過對上述核酸分子雜交技術發(fā)展和延伸，在微生物檢測領域更應用了基因芯片(DNA chip)技術，該技術是通過微加工技術，將數以萬計甚至百萬計的基因探針有規(guī)律地排列成二維DNA探針陣列，固定后與標記的樣品分子進行核酸雜交，用于基因檢測工作。基因芯片技術的特點是除了縮短了確診所需要的時間外，還能檢測出病原體耐藥的情況。但基因芯片技術同樣還有些問題有待解決，如提高芯片的特異性和檢測信號的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多數芯片都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因芯片到目前主要局限于實驗室研究而未能廣泛應用于臨床病原微生物的檢測與鑒定[1]。

3.3聚合酶鏈反應技術

作為一種DNA的體外擴增技術，聚合酶鏈反應技術是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段并進行擴增的技術。利用PCR可以對待測基因進行擴增的特性對病原體感染進行早期診斷，是特別適用的。如果特異性不強，可能會造成假陽性的出現(xiàn)，雖是如此，PCR技術仍然發(fā)展迅速，通過對PCR技術進行改進，使之派生出許多新用途，從而使PCR技術得到了進一步的完善。其中多重PCR、實時熒光定量PCR受到廣泛關注。

3.3.1多重PCR技術

多重PCR技術大量樣本的分析與鑒定適合采用此方法。目前采用基因芯片技術與多重PCR相結合的技術也大量應用于實際工作中。由于通過PCR對目的基因進行放大結合基因芯片的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，如此達到兩種檢測技術優(yōu)勢的充分發(fā)揮[2]。

3.3.2實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個進程，其特點是靈敏高、特異性強，同時能夠有效地解決PCR污染問題。熒光基團標記的特異性引物能夠反映病原體感染和藥物療效，大多應用于不可人工培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的病原體感染的診斷。

4　未來展望

從應用角度出發(fā)，無論是臨床診療還是疾病預防，快速準確地對病原體進行檢測和鑒定都有著十分重要的意義。當前生物學研究已由宏觀領域向微觀領域的迅速發(fā)展，病原體檢測方法也隨之延伸到分子水平和基因水平[3]。病原微生物高通量檢測技術的快速推進，無疑是適應未平發(fā)展需求的結果，由于這些技術具有方便快速、結果精確、無污染及自動化程度高等優(yōu)點，因此在未來的應用中，高通量診斷技術在病原微生物的診斷分析方面起到的作用將會越來越重要。

[1] 蔡挺,李巧云，張順，等. 基因芯片技術檢測常見革蘭陰性桿菌耐藥基因的研究[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志，2011，21(21)：4111-4112.

[2] 王曉宏，熊正英. 多重PCR-質譜聯(lián)用技術在病原體檢測中的應用及比較[J]. 微生物學免疫學進展，2011，39(4)：81-83.

[3] 賀晨，孫鴻燕，邵麗筠，等. 多重PCR結合基因芯片技術檢測11種致病菌方法的建立[J]. 中國實驗診斷學，2011，15(4)：587-591.

Progress Pathogen Detection Technology

ZHANG Yanqiu, Mulan County Disease Control and prevention Center, Haerbin 151900, China

Rapid identification of pathogenic microorganisms upgrading inspection techniques very quickly, mainly due to microbial physiological characteristics, the variety and variability of their rapidly. Pathogens rapid and accurate detection is essential. Conventional detection methods complex operation, time-consuming, and extremely high demands on the operator, has been far from satisfying a variety of pathogens present diagnostic and epidemiological studies, rapid microbial detection technology must be developed in order to adapt to the future development of Claim.

Microorganism, Detection technology, Progress

R446.5

B

1674-9308（2015）09-0175-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.09.151

151900 哈爾濱市木蘭縣疾病預防控制中心