補腎利濕法對急性痛風性關節炎大鼠血清MMP-7影響的實驗研究

姜德友 ，鄒 麗，隋方宇，陳 飛，喬 羽，李富震，李文昊，韓潔茹

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150040)

痛風是因嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄障礙導致血尿酸升高，尿酸鹽結晶沉著于關節及其他組織而引起病損及炎癥反應的一種疾病［1-3］。痛風性關節炎則是由于血清及體液中尿酸升高，至尿酸鹽結晶沉著于各種間葉組織中，當關節受累時而發病［4］。本研究采用尿酸鈉聯合氧嗪酸鉀誘導大鼠急性痛風性關節炎模型，分別用痛風舒片、秋水仙堿片、補腎利濕法中藥復方進行干預，測量急性痛風性關節炎大鼠血清MMP-7含量，探索補腎利濕法對急性痛風性關節炎防治機理。

1 實驗材料

健康雄性SD大鼠84只，體質量(200±20)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(黑)2013004，飼養溫度(20±2)℃，相對濕度:40%-45%，通風良好，環境適宜。補腎利濕法處方為姜德友教授經驗方(熟地、山茱萸、懷牛膝等)［5］，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房一次性選購。痛風舒片(車前子、澤瀉、防己、牛膝)購于湖北綠金子藥業有限責任公司，批號:140301。秋水仙堿片購于西雙版納藥業有限責任公司，批號140807。氧嗪酸鉀鹽購于美國 Sigma公司，批號:CAS2207-75-2。微晶尿酸鈉結晶購于美國 Sigma公司，批號:CAS1198-77-2。大鼠血清UA、MMP-7 Elisa試劑盒購于北京誠森生物技術有限公司，產品批號:201501。電子天平(梅特勒公司，型號:AL204)、高速臺式離心機(貝克曼公司，型號:X-22R)、恒溫鼓風干燥箱(上海一恒，型號:DHG-9140A)、酶標儀(基因有限公司，型號:synergyH7)。

2 實驗方法

2.1 溶液制備 尿酸鈉懸濁液制備:將微晶尿酸鈉結晶加入滅菌注射用水，配制成0.1 g/mL尿酸鈉懸濁液。氧嗪酸鉀溶液制備:將3 g的氧嗪酸鉀晶體溶解于97 mL的滅菌注射用水中，加熱攪拌，配制成3%氧嗪酸鉀溶液［6］。秋水仙堿混懸液的制備:將秋水仙堿片研末，配置成0.028 mg/mL的秋水仙堿混懸液，4℃保存備用。痛風舒混懸液制備:將痛風舒片研末，配置成0.029 g/mL的痛風舒片混懸液，4℃保存備用。補腎利濕法中藥復方溶液制備:補腎利濕法中藥復方藥液由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院提供，于60℃水浴中濃縮成含生藥1、2、4 g/mL藥液，高溫消毒裝瓶，4℃保存備用。

2.2 分組及給藥方法 將84只SD大鼠，適應性喂養1周后隨機分為7組:空白組、模型組、中藥對照組、西藥對照組、中藥復方低、中、高劑量組，每組12只［7］。以每100 g大鼠體質量灌胃1 mL為標準。空白組、模型組分別灌胃生理鹽水;中藥對照組灌胃痛風舒混懸液;西藥對照組灌胃秋水仙堿混懸液;中藥復方低、中、高劑量組分別灌胃補腎利濕法中藥復方溶液(含生藥劑量依次為10、20、40 g/kg);每日1次，連續灌胃7 d，末次灌胃1 h后造模。

2.3 造模方法 空白組按3 mL/100 g體質量腹腔注射生理鹽水，15 min后用BD針將0.2 mL生理鹽水從大鼠右膝關節外側以30°～40°向內斜插入并注入膝關節腔內。其余各組用3%氧嗪酸鉀溶液按3 mL/100 g體質量腹腔注射，15 min后用BD針在大鼠右膝關節外側以30°～40°向內斜插入至膝關節腔內，將0.2 mL尿酸鈉溶液注入到膝關節腔內［8］。

2.4 標本采集及測量 血清指標采集及測定:各組造模4 h后眶下取血，隨即處死。全血室溫靜置1 h后，4 000 r/min離心10 min，分離血清。按ELISA試劑盒說明書測定大鼠血清中UA及MMP-7含量。病理組織檢測:取大鼠右膝關節滑膜組織，95%乙醇溶液固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察滑膜組織病理變化。

2.5 統計學分析 運用SPSS 17.0軟件分析，若數據屬于正態分布、方差相齊則采用單因素方差分析、LSD-t檢驗;否則采用非參數檢驗，結果用均數±標準差(珋x±s)表示。

3 結果

3.1 病理組織觀察 空白組滑膜細胞形態規則，排列整齊。模型組滑膜組織內見有尿酸鹽結晶體，其周圍見大量中性粒細胞浸潤，滑膜組織明顯水腫、炎性滲出;與空白組比較，模型組大鼠血尿酸水平明顯升高(P＜0.01)，提示造模成功。中藥對照組滑膜組織仍見水腫、壞死、大量中性粒細胞浸潤，但滲出減輕。西藥對照組滑膜組織仍見有輕度炎性滲出及水腫，但有血管增生。中藥低劑量組滑膜組織仍有水腫與炎性滲出，大量中性粒細胞浸潤。中藥中劑量組滑膜組織有水腫，但無滲出及炎細胞浸潤。中藥高劑量組滑膜組織有炎細胞浸潤，水腫減輕，滲出減輕(見圖1)。

圖1 各組大鼠關節滑膜組織病理學報告(HE染色，×400)

3.2 MMP-7含量測定 模型組與空白組比較大鼠血清MMP-7含量水平顯著升高(P＜0.01);中藥對照組，西藥對照組，復方中藥低、中、高劑量組大鼠血清MMP-7含量均較模型組顯著降低(P＜0.01)，提示各組藥物均可降低其含量;復方中藥中劑量組與中藥對照組、復方中藥低、高劑量組相比差異有統計學意義(P＜0.01)，但與西藥對照組相比差異無統計學意義(見表1)。

表1 不同治療方法對各組大鼠血清中MMP-7水平影響(珋x±s，n=11)

4 討論

急性痛風性關節炎是尿酸鹽在關節及關節周圍組織沉積后引起的急性炎癥反應［9］。我國目前關于其致病指標主要以白介素、前列腺素等居多，雖然MMP-7作為一個常規的腫瘤研究指標［10］，但經實驗證實，其與急性痛風性關節炎的發生也有緊密聯系。MMP-7是一種基質溶解素，主要表達于上皮細胞中，在正常黏膜上皮細胞中為弱表達或不表達，在基質細胞中則不表達［11］，為基質金屬蛋白酶(MMPs)成員之一。在生物學行為上，MMPs與炎癥、基質降解、細胞生長、血管新生、腫瘤的轉移和侵襲等都有密切關系［12］。此外，MMPs家族成員一般由5個功能不同的結構域組成［13］，其中的類血紅蛋白結合區與酶的底物特異性有關。與其他的MMPs相比，由于MMP-7缺乏C-末端血紅素樣結構，不含類血紅素結合區，因而具有更為廣泛的底物特異性和基質降解功能。在正常軟骨中，軟骨細胞會把合成的大量II型膠原、蛋白多糖(PG)等物質分泌到細胞外基質(ECM)中，構成細胞外纖維網架，給細胞提供支持與保護［14］，而這些物質最終在基質金屬蛋白酶(MMPs)的作用下降解。當病變時，病變滑膜分泌大量的蛋白酶(包括基質金屬蛋白酶等)，而MMP-7是促進關節軟骨基質降解的重要酶類，因其具有強大的底物降解功能，它的增多導致關節軟骨MMPs/TIMPs平衡遭到破壞，最終導致疾病的發生。同時MMPs在痛風性關節炎的發病中介導了炎癥細胞，參與炎癥反應。并據研究發現，MMP-7主要由腺上皮細胞及巨噬細胞等分泌。而腺上皮細胞及巨噬細胞是參與炎癥級聯反應的主要部分之一。據報道，這些炎癥細胞、細胞因子及炎性體在急性痛風性關節炎的發生與發展中起著重要作用。并且有研究表明，MMP-7可參與宿主自身的防御，促使迅速釋放腫瘤壞死因子，從而啟動了間質炎癥反應［11］。本研究結果可以看到模型組大鼠血清MMP-7濃度明顯高于空白組(P＜0.01)，提示MMP-7可能參與了痛風性關節炎急性期的發病過程，所以推測其作為一個炎性指標與痛風性關節炎的發生有著緊密聯系。且大鼠血清中MMP-7的含量變化，與病理組織炎癥反應程度呈正相關性。

中醫學將痛風性關節炎歸屬于“歷節病”“熱痹”“白虎病”等范疇。臨床表現為發病急驟、受累關節明顯紅腫熱痛、晝輕夜重、疼痛劇烈難忍、足不能履地。本病病機為素體感受風濕熱邪，郁而化熱，或飲食不節，偏嗜高粱厚味［15］，導致濕熱內盛，壅滯經絡，流注關節，使關節紅腫熱痛。目前臨床大多采用秋水仙堿或其他糖皮質激素類藥物進行治療，但此類藥物的運用常伴有惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道等不良反應。姜德友教授根據自身多年臨床經驗，認為痛風性關節炎以腎虛為本，濕邪為標，乃本虛標實之證，因此確立了補腎利濕法治療本病。補腎利濕法中藥復方重用熟地黃以補血滋腎，益精填髓;山茱萸入肝腎二經，氣溫而主補，味酸而主斂，故精氣益而腰膝強也。且山茱萸既可補陰又可補陽，為平補肝腎之品，與熟地合用，取肝腎同源之說;山藥，脾腎同補，補腎固精，且補脾以助后天生化之源。清末張錫純對此藥更是推崇備至，在其醫學專著《醫學衷中參西錄》中曾屢用山藥。其言:“山藥之性，能滋陰又能利濕，能滑潤又能收澀。是以能補肺、補腎、兼補脾胃。”熟地黃、山茱萸、山藥三藥相伍，肝脾腎同補，起到“三陰并補”之效。澤瀉，利濕泄濁，并防熟地之滋膩。在《藥鑒》中曾記載:“澤瀉……主分利小水之捷藥也。又能除濕……仲景八味丸用之，亦不過接引諸藥歸于腎經耳。”茯苓淡滲以利濕，《本草疏證》謂其“能排臟腑、廓肌膚之諸水”。萆絯有祛風利濕之效。《藥品化義》:“萆絯，性味淡薄，長于滲濕，帶苦亦能降下，主治風寒濕痹。“牛膝取補肝腎，強筋骨，活血通經引血下行，利尿通淋之效，可使諸藥引經下行于關節處。《醫學衷中參西錄》:“牛膝，原為補益之品，而善引氣血下注，是以用藥欲其下行者，恒以之為引經。故善治腎虛腰疼腿疼，或膝疼不能屈伸，或腿痿不能任地。”此幾味藥物合用，共奏補腎利濕，通絡化瘀之功。血脈通，濕氣除，則筋脈得以舒養，故對急性痛風性關節炎有很好的防治作用。

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