芪參清幽膠囊微生物限度檢查方法驗證

劉元昆張立賢

（1威海市中醫院，山東威海264200；2威海市經區醫院）

芪參清幽膠囊微生物限度檢查方法驗證

劉元昆1張立賢2

（1威海市中醫院，山東威海264200；2威海市經區醫院）

目的：建立芪參清幽膠囊微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》（2010年版）的規定，進行該品種微生物限度檢查方法的驗證。結果：常規法試驗芪參清幽膠囊對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抗菌作用，回收率小于70%；培養基稀釋法可消除本品對上述2種菌株的抗菌作用，回收率大于70%；常規法試驗能檢出大腸埃希菌。結論：本品可用常規法進行霉菌和酵母菌數測定；可用培養基稀釋法進行細菌測定；可用常規法進行控制檢驗。

芪參清幽膠囊；微生物限度；方法驗證

芪參清幽膠囊由黃芪、丹參、白花蛇舌草、蒲公英等11味中藥材組成，具有理氣和胃、消瘀止痛之功效。適用于濕熱淤滯證的慢性胃炎（Hp＋），癥見胃脘疼痛、痞滿腹脹、喛氣返酸等。為保證藥品質量，按照《中國藥典》（2010年版）的要求，并參考其他標準和文獻的基礎上[1-3]，對其微生物限度檢查方法進行驗證。

1 材料

1.1 儀器

SHP-100生化培養箱（金壇市盛藍儀器制造有限公司）；LMQ.C-50K型立式滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）；GSP-9160MBE隔水式電熱恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司）；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋（上海光學儀器一廠）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱（金壇市盛藍儀器制造有限公司）。

1.2 樣品

芪參清幽膠囊（批號：130201，130501，130801），均來源于威海市中醫院制劑室。

1.3 培養基及稀釋劑

營養瓊脂（批號：121025），玫瑰紅鈉瓊脂（批號：121115），營養肉湯（批號：111205），改良馬丁（批號：140114），改良馬丁瓊脂（批號：120113），膽鹽乳糖（批號：130114），4-甲基傘形酮葡糖苷酸（批號：130827），乳糖膽鹽發酵（批號：121109），曙紅亞甲蘭瓊脂（批號：1211222），北京三藥科技開發公司生產，經檢查適用性符合《中國藥典》（2010年版）要求。所用稀釋劑為pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液。

1.4 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]第4代，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]第4代，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]第4代，白色念珠菌[CMCC（F）98 001]第4代，黑曲霉[CMCC（F）98 003]第4代，菌種均由山東省食品藥品檢驗所提供。

2 方法

按照《中國藥典》（2010年版）一部微生物限度檢查法[4]附錄進行。

2.1 菌液制備

2.1.1 各取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮斜面培養物1白金耳接種至10 m L營養肉湯培養基中，經30～35℃培養18～24 h。用無菌0.9%氯化鈉溶液，10倍稀釋至每1 m L含菌數為50～100 cfu，備用。

2.1.2 取白色念珠菌的新鮮斜面培養物1白金耳接種至10 m L改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48 h。用無菌0.9%氯化鈉溶液，10倍稀釋至每1 m L含菌數為50～100 cfu，備用。

2.1.3 取黑曲霉的新鮮斜面培養物接種至改良馬丁瓊脂培養基上，23～28℃培養5～7天至大量孢子產生。加入3～5 m L含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子菌液，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至每1 m L含孢子數為50～100 cfu，備用。

2.2 供試液制備

稱取樣品10 g，研磨，加入45℃無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 m L，混勻，作為1∶10的供試液。

2.3 常規法細菌、霉菌和酵母菌驗證試驗

2.3.1 試驗組 取1∶10的供試液1 m L和各試驗菌1 m L（含菌數50～100 cfu）于無菌平皿中，然后分別傾注15～20 m L溫度不超過45℃的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，分別倒置于平皿33℃培養3天或25℃培養5天。每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.3.2 菌液組 取上述各試驗用菌液1 m L注入平皿內，測定所加的試驗菌數。

2.3.3 供試品對照組 取1∶10的供試液1 m L，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

以上重復進行3次獨立的平行試驗，分別計算各試驗菌的回收率。

表1 常規法試驗細菌、霉菌和酵母菌回收率結果

2.3.4 常規法試驗結果表明，本品對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有抗菌作用，回收率小于70%，故不能采用常規法進行細菌數測定；但白色念菌珠菌和黑曲霉回收率大于70%，可以采用常規法進行霉菌和酵母菌數測定。

2.4 培養基稀釋法細菌驗證試驗

2.4.1 取1∶10的供試液0.2 m L和各試驗菌1 m L（含菌數50～100 cfu）于無菌平皿中[5]，方法同常規法進行試驗。結果見表2。

2.4.2 試驗結果表明，試驗組菌數回收率均在70%以上，可采用培養基稀釋法進行細菌數的測定。

表2 培養基稀釋法試驗細菌回收率結果

2.5 常規法控制菌檢查方法驗證試驗

2.5.1 試驗組 取1∶10的供試液10 m L及大腸埃希菌液（50～100 cfu/m L）1 m L，注入100 m L膽鹽乳糖培養基中,置于30～35℃培養18～24 h。依據大腸埃希菌檢查法進行試驗。

2.5.2 陽性對照組 取大腸埃希菌液（50～100 cfu/m L）1 m L，注入100 m L膽鹽乳糖培養基中,置于30～35℃培養18～24 h。依據大腸埃希菌檢查法進行試驗。

2.5.3 陰性對照組 取稀釋液10 m L，注入100 m L膽鹽乳糖培養基中，置于30～35℃培養18～24 h。依據大腸埃希菌檢查法進行試驗。

表3 常規法試驗大腸埃希菌結果

2.5.4 結論 上述試驗結果表明，可用常規法檢查大腸埃希菌。

3 3批樣品的驗證

通過以上試驗得知，可以用常規法進行霉菌和酵母菌數測定，也可以用常規法對控制菌進行測定，而對于細菌數的測定需采用培養基稀釋法。為確保試驗結果的可靠性，對該制劑按驗證方法進行了3批樣品（批號為131001，131002，131003）的驗證。結果見表4～6。

表4 培養基稀釋法試驗細菌回收率結果

表6 常規法試驗大腸埃希菌結果

4 討論

芪參清幽膠囊用于治療幽門螺旋桿菌引起的慢性胃炎，現代研究表明，方中丹參、蒲公英等對金黃色葡萄球菌有較強的殺菌作用，白花蛇舌草內服后抗感染作用明顯，所以該制劑對微生物的生長應該具有抑制作用。通過本次驗證，可以得出如下結果：常規法對于大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率大于70%，說明該制劑對上述菌無抑菌作用；而對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率小于70%，說明該制劑對這2種菌有抗菌作用，因此需采用培養基稀釋法進行試驗，采取每1 m L傾注5個平皿，結果顯示：后兩者的回收率均大于70%；另外，常規法試驗表明，該制劑對大腸埃希菌的檢查無影響。所以可以用常規法對芪參清幽膠囊霉菌及酵母菌、控制菌進行檢查，用培養基稀釋法對細菌進行檢查。通過該試驗，說明對中藥制劑進行微生物驗證是非常必要的。

[1]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范（2010年版）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-389.

[2] 蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京：華齡出版社，2007：209-236.

[3]趙會蘭.20種中成藥微生物限度檢查方法驗證[J].中國執業藥師，2014，11（2-3）：21-24.

[4]國家藥典委員會.中國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-88.

[5]董建英，趙會蘭.黃藤素片微生物限度檢查方法驗證研究[J].中國執業藥師，2012，9（5）：36-39.

Research on the M ethod Validation of M icrobial Lim it Test for Qishenqingyou Capsules

Liu Yuankun1,Zhang Lixian2（Hospital of Traditional Chinese Medicine of Weihai City，Shandong Weihai 264200，China；2 Jingqu Hospital of Weihai City）

Objective：To establish a method of m icrobial lim it test for qishenqingyou capsules.M ethods：According to the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition，the method validation of m icrobial lim it test on qishenqingyou capsules was conducted.Results:By using the conventional test methods，the antibacterial actions of qishenqingyou capsules were showed for Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus，and the recovery rate was less than 70%.The culture medium dilution method could eliminate the antibacterial activity of the product for the above two strains,and the recovery rate was greater than 70%.The conventional test methods can detect Escherichia coli in the product.Conclusion：For the product，the conventional test methods can be used for the bacterial counting test of mould or yeast and the control tests of bacteria，and the dilution method can be used for determ ination of bacteria.

Qishenqingyou Capsules；M icrobial Limit；Method Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.01.007

2014-09-10）

劉元昆，女，主管藥師。研究方向：中藥制劑。E-mail：zijingpi123@sina.com