免疫微球檢測金黃色葡萄球菌與鏈球菌研究

薛士鵬

免疫微球檢測金黃色葡萄球菌與鏈球菌研究

薛士鵬

目的 研究金黃色葡萄球菌與鏈球菌的檢測方法。方法 制備三種免疫磁性微球作為載體, 利用存在于金黃色葡萄球菌表面的A蛋白、存在于G群鏈球菌表面的G蛋白、免疫球蛋白G(IgG)分子特異性結合的相關原理對病原菌進行檢測。結果 三種免疫磁性微球均可有效地捕捉到G群鏈球菌、金黃色葡萄球菌。結論 應用免疫微球對金黃色葡萄球菌、鏈球菌進行檢測具有良好的穩定性, 在微生物檢測及臨床檢驗過程中可推廣應用。

免疫磁性微球；病原菌；檢測

金黃色葡萄球菌(S.aureus)和G群鏈球菌(GGS)是極具代表性的醫源性感染及群發性感染病原菌［1］。金黃葡萄球菌(簡稱金葡菌)是一種可引起人和動物化膿感染的重要致病菌,也是常見的食源性致病菌。該菌廣泛分布于空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中, 食品較易受其污染［2］。臨床中應用的傳統病原微生物檢測方法操作復雜, 檢測時間長, 速度較慢, 已經無法適應臨床快速診斷及治療需要［2］。本次研究主要對金黃色葡萄球菌與鏈球菌的免疫微球檢測情況進行分析, 現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本次研究所應用到的主要材料及試劑：人IgG、小牛血清、羊抗鼠IgG、表面帶醛基磁性微球、表面帶氨基磁性微球、金屬螯合磁性微球、乙醛-右旋糖苷等。

1.2 方法 ①磁性微球的免疫化。用高碘酸鈉將人IgG分子氧化后保存與磷酸鹽緩沖液中。分別人IgG融入3種存在不同基團的磁性微球中, 在4℃的溫度下保存1晚。應用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行3次清洗, 應用雙蒸水(ddH2O)對微球進行充分洗滌, 然后放置備用。②乙醛-右旋糖苷的包被。將乙醛-右旋糖苷融入到懸浮有醛基免疫磁性微球的pH=7.6中, 在室溫環境中進行振蕩培養, 培養時間為12 h。將固態形式的硼氫化鈉加入到pH=10中, 讓其方式持續性反應2 h, 然后使用PBS進行洗滌。應用ddH2O進行洗滌, 將已經磁性微球所吸收的相關右旋糖苷除去。③免疫磁性微球承載人IgG分子能力。分別應用不同量的人IgG分別加入到2 ml三種免疫磁性微球的PBS中, 在4℃的溫度下進行1晚孵育。應用ddH2O進行充分洗滌, 然后使用Bradford方法對免疫磁性微球固定蛋白量進行檢測。④不同磁性微球固定化人IgG分子速率。將人IgG分子(10 mg)分別添加到3種磁性微球中, 應用Bradford方法對存在于上清液中的蛋白濃度進行檢測, 檢測頻率為30 min檢測1次。⑤親和捕捉病原菌實驗。將0.95 ml G族鏈球菌、0.95 ml金黃色葡萄球菌、0.95 ml大腸桿菌混合而成的混合物分別溶于0.1 ml三種免疫磁性微球, 在室溫狀態下進行孵育。孵育的時間分別為10 min、20 min、1 h、2 h。然后進行磁場分離操作, 將混合物取出, 并將其清涂于平板之上。在37℃的溫度下進行1晚培養, 對菌落形成單位進行詳細記錄。⑥親和捕捉病原菌的免疫印記分析。將3種免疫化磁性微球(1 ml)分別溶入G群鏈球菌(9 ml)、金黃色葡萄球菌(9 ml)當中, 在37℃的溫度下進行孵育, 孵育的時間為1 h。然后將一定量的溶菌酶加入,同樣在37℃的溫度下進行孵育, 孵育的時間為30 min, 然后進行磁場分離操作, 將研究所用樣品進行15 min的煮沸。煮沸過后裝上清20 μl取出, 實施下一步的蛋白電泳分離操作。電泳分離操作完畢后會形成兩塊凝膠, 對其中一塊凝膠進行染色、脫色相關處理, 應用免疫印記對另一塊上存在的蛋白進行檢測。

2 結果

2.1 不同磁性微球固定化人IgG分子速率情況 3種磁性微球對IgG進行固定化的速率均各不相同。醛基磁性微球與氨基磁性微球的固定化速率存在較小差異。在金屬螯合磁性微球中, 其固定化速率表現為前30 min明顯較快, 30 min后明顯下降。

2.2 各微球表面固定人IgG分子的SDS-PAGE檢測情況通過對上清樣品實施SDS-PAGE分析操作后發現, 各磁性微球的IgG分子裝載能力各不相同, 但當同時給予磁性微球各10 mg人IgG分子時, IgG分子均全部被固定于相應磁性微球表面。

2.3 不同免疫磁性微球親和捕捉病原菌效果及親和捕捉病原菌的免疫印記實驗效果 3種免疫化磁性微球都可在較短的時間有效地對病原菌進行捕捉和分離, 醛基免疫化磁性微球的捕捉和分離的效率最佳。3種免疫磁性微球均可有效對G群鏈球菌、金黃色葡萄球菌進行捕捉。

3 討論

臨床診斷及檢查過程中所用的金黃色葡萄球菌、G群鏈球菌的鑒定、檢測和分離方法存在操作復雜、應用成本高、檢測時間長等諸多局限性［3］。因此加強對金黃色葡萄球菌、G群鏈球菌有效檢測方法進行深入研究成為一個熱門課題,對臨床診斷技術的提高具有重要意義［4］。在本次研究中, 主要應用捕捉病原菌的方法和分離病原菌方法來實現對黃色葡萄球菌和鏈球菌進行檢測。研究結果顯示, 應用該種方法有效提高了操作的簡便性, 大大縮短了檢測時間。本次研究中所用的方法體系可通過樣品孵育, 然后再進行磁場分離兩個步驟, 在短短的1 h之內便可將分離出來的G群鏈球菌、金黃色葡萄球菌進行鑒定, 大大提高了病原微生物的檢測效率和質量。若通過在磁珠的表面接上不相同的各種抗體, 可實現將其他細胞、蛋白進行分離。

綜上所述, 金黃色葡萄球菌普遍存在, 是院內感染及食物中毒的主要病菌之一, 致病力強, 對人體健康危害大。因此需加強金葡菌致病機理的研究, 并研制科學有效的快速檢測方法, 促進其檢測效率得到有效提高, 具有重要的臨床意義。

［1］ 劉琳琳.免疫微球檢測金黃色葡萄球菌與鏈球菌研究.中國熱帶醫學, 2008, 8(2):193-195.

［2］ 薛力剛, 劉金華, 王全凱, 等.金黃葡萄球菌核酸探針檢測方法的建立.中國生物制品學雜志, 2012, 11(8):215-216.

［3］ 陳清, 王雅賢, 俞守義.膠體金免疫層析法檢測金黃色葡萄球菌的初步研究.熱帶醫學雜志, 2013, 12(12):372-373.

［4］ 鈕博, 王敏.金黃色葡萄球菌抗體的檢測與臨床意義.淮海醫藥, 2012, 8(35):188-199.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.21.205

2015-02-02］

473061 南陽醫學高等專科學校