膜型基質金屬蛋白酶—1表達對肝細胞癌血管生成擬態形成的影響

程銳等

[摘要] 目的 研究膜型基質金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）表達對肝細胞癌血管生成擬態（VM）形成的影響及機制。 方法 構建靶向MT1-MMP的RNA干擾質粒載體，轉染肝癌細胞系Bel7402，實時定量PCR及Western blot檢測干擾效果；在體外三維細胞培養體系中觀察其對VM管狀結構形成的影響；Transell侵襲小室實驗檢測細胞侵襲能力。 結果 靶向抑制MT1-MMP的表達下調腫瘤細胞侵襲能力，影響肝癌細胞在三維細胞培養體系中VM管狀結構的形成。 結論 MT1-MMP表達影響肝細胞癌VM的形成，可能成為肝細胞癌抗血管生成治療的新靶點。

[關鍵詞] 肝細胞癌；基質金屬蛋白酶；血管生成擬態；RNA干擾

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（c）-0013-04

Eeffects of expression of membrane-type 1 matrix metalloproteinase on vasculogenic mimicry formation in hepatocellular carcinoma

CHENG Rui CAI Xinran ZHOU Haohui KE Kun CHEN Yanling

Department of Hepatobiliary Surgery， Union Hospital Affiliated to Fujian Medical College， Fujian Province， Fuzhou 350001， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of MT1-MMP on vasculogenic mimicry （VM） formation in hepatocellular carcinoma （HCC） and discuss its possible mechanisms. Methods RNA interfere plasmid targeting MT1-MMP was constructed and transfected into a HCC cell lines. Interference effect was detected by real time PCR and Western blot. VM networks in 3D cell culture system were observed with a microscope. Cell invasion assay was performed using 24-well transwell. Results Inhibition of MT1-MMP expression impaired VM network formation in vitro by down-regulating cell invasion. Conclusion MT1-MMP influences vasculogenic mimicry formation in HCC cell line and offers a potential molecular target for HCC antiangiogenesis therapy.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Matrix metalloproteinase； Vasculogenic mimicry； RNAi

1999年Maniotis等[1]在對眼葡萄膜色素瘤及轉移性皮膚黑色素瘤的研究中發現一種無內皮細胞參與，由腫瘤細胞排列形成的管道結構，血管造影證實其參與腫瘤的血液供應。他們將這種血管樣結構命名為血管生成擬態（vculogenic mimicry，VM）。VM合理的解釋了目前針對內皮細胞的抗血管生成藥物實際療效與預期存在較大差距的原因，對經典的抗腫瘤血管生成治療理論提出了挑戰[2]。后續的研究證實VM存在于多種高侵襲性的腫瘤，且存在VM的患者預后不佳[3-5]。原發性肝細胞癌是一種惡性程度、侵襲性高的實體腫瘤，手術切除后復發率高，預后較差[6-7]。肝細胞癌中VM的存在已被證實[8-10]。但目前肝細胞癌VM形成機制及治療靶點的研究仍處于起步階段。本研究擬探討膜型基金屬蛋白酶（MT1-MMP）表達對肝細胞癌VM生成的影響，為肝細胞癌抗血管生成治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

Bel 7402肝癌細胞系購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；兔抗人MT1-MMP抗體購于英國Abcam公司；胎牛血清、DMEM培養基、PCR 引物、Trizol RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、Lipofectamine 2000TM脂質體、質粒抽提試劑盒購于美國Invitrogen公司；易必迪血管生成板（IBIDITM μ-slide）購于德國Ibidi公司；基質膠購于美國Corning公司Tanswell侵襲小室購于美國Millipore公司；蛋白抽提試劑盒購于杭州碧云天生物科技有限公司；羊抗兔二抗、BCA蛋白定量試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 MT1-MMP的siRNA質粒的構建

根據RNA干擾序列設計原則，設計2條靶向MT1-MMP基因的RNA干擾靶點序列分別為ATCACTT-TCTGCATCCAGA和GTACTACCGTTTCAACGAA。合成含干擾序列的DNA雙鏈，酶切后連接入同一真核質粒載體pGenesil 1.2中。連接產物轉化感受態細胞，所獲克隆行PCR鑒定。

1.3 細胞轉染及MT1-MMP表達的檢測

Bel7402細胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養基中進行培養，置于37℃含5%CO2的溫箱中。細胞分為兩組：siRNA組使用RNA干擾質粒載體進行轉染；陰性對照組使用陰性對照質粒轉染；使用Lipofectamine 2000TM脂質體進行質粒轉染。轉染24 h后，消化貼壁生長的Bel7402細胞，1000 r/min離心5 min， 離心半徑為13.5 cm。收集細胞，PBS 洗滌兩次，轉移至EP管中，5000 r/min離心1 min，棄去上清。使用Trizol抽提總mRNA，按說明書使用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA分子。根據PCR引物設計的原則，軟件設計 PCR引物：上游5′-CTGCCTACCGACAAGATTGATG-3′；下游 5′-TCCCTTCCCAGACTT-TGATGTT-3′實時熒光定量PCR檢測各組細胞中MT1-MMP mRNA表達，磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參，每個樣本做3個復孔。結果采用2-△△CT法分析。

按蛋白抽提試劑盒說明書操作，抽提各組細胞的總蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉后，與兔抗人MT1-MMP抗體作用，二抗標記后進行顯色。用凝膠圖象分析系統處理膠片，采用Image J軟件進行相對定量分析。GAPDH作為內參，每個樣本做3個復孔。

1.4 三維細胞培養

向IBIDITM μ-slide血管生成板中加入基質膠，每孔加入10 μL，置于37℃靜置30 min待基質膠塑形。收集轉染24 h后的細胞、制成細胞懸液，以2×105 個/孔的濃度加入到基質膠表面，37℃培養48 h。顯微鏡觀察VM管狀結構的形成情況。Transwell侵襲實驗檢測體外細胞侵襲力用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。然后將小室放入培養板中，在上室加入100 μL預溫的無血清培養基，室溫下靜置30 min，使基質膠水化。轉染后的細胞用PBS清洗2次，然后用含BSA的無血清培養基重懸細胞，調整細胞密度至1×105/mL，取細胞懸液100 μL加入Transwell小室，接著向24孔板下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培養基，置于37℃ 5% CO2的培養箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去上室內的細胞；用甲醛固定細胞，后用0.1%結晶紫染色；400倍光鏡下隨機計數10個視野內的細胞數，取穿膜平均細胞數值表示腫瘤細胞侵襲能力，并進行統計處理。實驗重復3 次。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建并轉染靶向MT1-MMP基因的siRNA質粒載體

使用質粒抽提試劑盒抽提質粒后，用限制性內切酶酶切后行電泳檢測并測序，結果顯示酶切片段大小正確，構建成功。見圖1。

1：靶向膜型基質金屬蛋白酶-1的干擾序列PCR產物；2：質粒載體；DL2000 Marker（從左往右）：100、250、500、750、1000、2000 bp

圖1 構建的RNA干擾質粒載體用Hind Ⅲ+EcoRⅠ酶切后電泳圖

2.2 siRNA質粒轉染抑制MT1-MMP表達

使用Lipofectamine 2000TM脂質體，將抽提獲得的siRNA質粒載體轉染Bel7402肝癌細胞系，熒光顯微鏡下觀察可見細胞有熒光報告基因的表達（圖2，封三），表明轉染獲得成功。質粒轉染24 h后的收集各組細胞，實時定量PCR和Western blot檢測干擾后MT1-MMP的表達情況結果顯示，siRNA組相對于陰性對照組，MT1-MMP基因的mRNA表達及蛋白表達均明顯下調，差異有統計學意義（P < 0.05）（圖3）。

2.3 三維細胞培養

在三維細胞培養體系中對各組細胞進行培養，實驗結果顯示，陰性對照組能形成典型的VM管腔樣結構，而siRNA組細胞不能形成VM結構（圖4，封三）。提示靶向抑制Bel7402細胞中MT1-MMP的表達影響其在三維細胞培養體系中VM管狀結構的形成。

2.4 Transwell侵襲實驗

為研究MT1-MMP表達抑制對肝癌細胞侵襲力的影響，本研究采用了Transwell侵襲實驗，將兩組細胞接種到Matrigel侵襲小室中，培養24 h后，對穿過Matrigel膠的細胞進行計數。結果顯示，siRNA組穿膜細胞的數量較陰性對照組明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.05），提示MT1-MMP的下調可降低Bel7402細胞的侵襲力。見圖5，封三。

3 討論

血管生成是實體腫瘤生長的決定性因素，而抗血管生成已成為腫瘤治療的研究熱點[11]。肝細胞癌血供豐富，且惡性程度高，手術切除率低，是抗腫瘤血管生成靶向治療的理想對象。經典的肝癌血管生成靶向治療主要針對內皮細胞，代表藥物如索拉非尼，目前已廣泛應用于臨床。然而這類靶向藥物的實際臨床療效與預期仍有較大差距[12]。肝細胞癌中VM的發現表明這類腫瘤存在不依賴內皮細胞的其他供血方式，從而為提高靶向藥物的療效提供了新的研究方向。

目前對于肝細胞癌VM形成的機制尚不明確，研究發現可能與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）密切相關[13]。MMPs由鋅離子依賴性蛋白酶組成，可以直接或間接作用于細胞外基質中的多種主要成分，并通過影響細胞黏附分子、生長因子及趨化因子等的生理功能，參與腫瘤細胞的遷移及血管生成過程，與腫瘤侵襲、轉移等病理生理過程密切相關，在腫瘤發生發展過程中起著重要作用[14]。MT-MMP是MMPs的一個亞家族，現發現有6種MT-MMP。其中MT1-MMP與惡性腫瘤的侵襲行為關系密切，且在原發性肝細胞癌中高表達[15]。Hess等[16]的研究發現通過阻斷磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路，抑制MT1-MMP的表達，能夠減少MMP2的活化，從而減少黑色素瘤細胞血管擬態的形成。故本研究認為，在原發性肝細胞癌中，MT1-MMP表達的上調很可能是血管生成擬態形成的重要機制，而MT1-MMP極有可能成為減少肝細胞癌中血管生成擬態形成、實現抗腫瘤血管生成治療的有效靶點。

基于以上認識，本研究構建了靶向MT1-MMP的RNA干擾質粒載體，轉染至肝癌細胞株Bel7402中，該細胞株已被證實在體外三維培養體系中能夠形成VM管狀結構。而本實驗中所使用的RNAi質粒載體是將兩個作用于MT1-MMP基因不同部位mRNA的shRNA構建入同一質粒載體，每個shRNA能獨立發揮RNA干擾的作用，從而更有效的實現基因沉默。實驗結果顯示，相對于對照組，siRNA組細胞中MT1-MMP在mRNA和蛋白水平的表達均受到明顯抑制。與此同時，siRNA組細胞在三維培養體系中形成VM管狀結構的能力也被抑制。此外，本研究對轉染后細胞的侵襲能力及MMP2、MMP9的活性進行了檢測，結果顯示抑制MT1-MMP的表達下調腫瘤細胞侵襲能力，而這可能是MT1-MMP影響肝細胞癌VM形成的潛在機制。

綜上所述，MT1-MMP表達能通過改變肝細胞癌細胞侵襲能力影響VM的形成，可能成為肝細胞癌抗血管生成治療的新靶點。

[參考文獻]

[1] Maniotis AJ，Folberg R，Hess A，et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro：vasculogenic mimicry [J]. Am J Pathol，1999，155（3）：739-752.

[2] Limaverde-Sousa G，Sternberg C，Ferreira CG. Antiangiogenesis beyond VEGF inhibition：a journey from antiangiogenic single-target to broad-spectrum agents [J]. Cancer Treat Rev，2014，40（4）：548-557.

[3] Chisblaem K，Lirdprapapamongkol K，Keeratichamroen S，et al. Curcumin suppresses vasculogenic mimicry capacity of hepatocellular carcinoma cells through STAT3 and PI3K/AKT inhibition [J]. Anticancer Res，2014，34（4）：1857-1864.

[4] Du J，Sun B，Zhao X，et al. Hypoxia promotes vasculogenic mimicry formation by inducing epithelial-mesenchymal transition in ovarian carcinoma [J]. Gynecol Oncol，2014， 133（3）： 575-583.

[5] Luo F，Yang K，Liu RL，et al. Formation of vasculogenic mimicry in bone metastasis of prostate cancer：correlation with cell apoptosis and senescence regulation pathways [J]. Pathol Res Pract，2014，210（5）：291-295.

[6] Chen J，Zhao J，Ma R，et al. Prognostic significance of E-cadherin expression in hepatocellular carcinoma：a meta-analysis [J]. PLoS One，2014，9（8）：e103952.

[7] Forner A，Gilabert M，Bruix J，et al. Treatment of intermediate-stage hepatocellular carcinoma [J]. Nat Rev Clin Oncol，2014，11（9）：525-35.

[8] Sun D，Sun B，Liu T，et al. Slug promotedal vasculogenic mimicry in hepatocellular carcinoma [J]. J Cell Mol Med，2013，17（8）：1038-1047.

[9] Liang Y，Huang M，Li J，et al. Curcumin inhibits vasculogenic mimicry through the downregulation of erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma-A2，phosphoinositide 3-kinase and matrix metalloproteinase-2 [J]. Oncol Lett，2014， 8（4）：1849-1855.

[10] Li Y，Cai W，Yi Q，et al. Lipid droplets may lay a spacial foundation for vasculogenic mimicry formation in hepatocellular carcinoma [J]. Med Hypotheses，2014，83（1）：56-59.

[11] Fakhrejahani E，Toi M. Antiangiogenesis therapy for breast cancer：an update and perspectives from clinical trials [J]. Jpn J Clin Oncol，2014，44（3）：197-207.

[12] Llovet JM，Ricci S，Mazzaferro V，et al. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma [J]. N Engl J Med，2008， 359：378-390.

[13] Sun T，Zhao N，Zhao XL，et al. Expression and functional significance of Twist1 in hepatocellular carcinoma：its role in vasculogenic mimicry [J]. Hepatology，2010，51（2）：545-556.

[14] Verma S，Kesh K，Ganguly N，et al. Matrix metalloproteinases and gastrointestinal cancers：impacts of dietary antioxidants [J]. World J Biol Chem，2014，26，5（3）： 355-376.

[15] Miyoshi A，Kitajima Y，Ide T，et al. Hypoxia accelerates cancer invasion of hepatoma cells by upregulating MMP expression in an HIF-1alpha-independent manner [J]. Int J Oncol，2006，29（6）：1533-1539.

[16] Hess AR，Seftor EA，Seftor RE，et al. Phosphoinositide 3-kinase regulates membrane type1-matrix metalloproteinase（MMP）and MMP-2 activity during melanoma cell vasculogenic mimicry [J]. Cancer Res，2003，63（16）：4757-4762.

（收稿日期：2014-05-25 本文編輯：任 念）