HPLC法同時測定肝甦顆粒中白藜蘆醇和綠原酸的含量

黃德福

HPLC法同時測定肝甦顆粒中白藜蘆醇和綠原酸的含量

黃德福

目的建立同時測定肝甦顆粒中白藜蘆醇和綠原酸含量的方法。方法采用高效液相色譜法(HPLC)。色譜柱為WondaSil C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm), 流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(25：75, V/V), 流速為1.0 ml/min, 檢測波長為305 nm, 柱溫為25℃, 進樣量為20 μl。結(jié)果白藜蘆醇的質(zhì)量濃度在1.0～81.0 μg/ml與其峰面積呈良好的線性關系(r=0.9997), 平均加樣回收率為100.5%(RSD=2.42%, n=6)；綠原酸的質(zhì)量濃度在9.6～307.2 μg/ml與其峰面積呈良好的線性關系(r=0.9996), 平均加樣回收率為99.7%(RSD=2.06%, n=6)。結(jié)論本方法準確、重現(xiàn)性好, 可用于肝甦顆粒的制劑質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；肝甦顆粒；綠原酸；白藜蘆醇；含量測定

肝甦顆粒由茵陳、虎杖、赤芍、車前草等15味中藥組成,通過水煎煮法提取而制成的顆粒劑。該方為院內(nèi)協(xié)定方, 臨床上用于治療肝膽濕熱、瘀血阻絡、脾虛氣滯所致黃疸不退,急慢性肝炎、肝衰竭見上述癥候者。方中茵陳、車前草和虎杖均為君藥, 其中茵陳具有清利濕熱、保肝利膽之功效[1]；車前草具有利尿、抗菌、治療慢性活動性肝炎的作用[2]；虎杖具有利膽退黃、清熱解毒、破瘀、通經(jīng)的功能[3]。茵陳和車前草均含有水溶性的綠原酸, 而虎杖中有效成分為水溶性差的白藜蘆醇, 因此, 通過水煎煮法能否同時提取兩種溶解性不同的有效物質(zhì), 需進一步驗證。而目前該制劑主要通過薄層色譜法進行質(zhì)量控制, 難以達到準確定量和驗證的目的。為了更好地評價和控制制劑質(zhì)量, 本實驗通過建立高效液相色譜法(HPLC)同時測定肝甦顆粒中綠原酸和白藜蘆醇含量,為該制劑的質(zhì)量控制提供定量檢測的方法, 并為提取工藝的進一步優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2550紫外分光光度計(日本島津公司)；LC-2010AHT高效液相色譜議(日本島津公司)；80-2臺式離心機(北京精誠華泰儀表有限公司)；SB-5200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥 白藜蘆醇對照品(純度98%, Sigma公司提供)；綠原酸對照品(純度98%, Sigma公司提供)；肝甦顆粒(福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院制劑室提供, 批號：121128、121212、121213, 規(guī)格：9 g/袋)；乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水,其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Wondasil C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸水溶液(25∶75, V/V)；檢測波長：305 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；進樣量：20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取適量的綠原酸和白藜蘆醇對照品, 分別置于10 ml容量瓶中, 用50%甲醇水溶液進行溶解稀釋, 配成濃度均為1.0 mg/ml的溶液, 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾, 備用。

2.2.2 陰性對照溶液的制備 取肝甦顆粒處方中去除虎杖、茵陳與車前草之后的其他12味藥材按提取工藝制備樣品,得陰性對照溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取肝甦顆粒1.0 g, 加50%甲醇水溶液適量, 超聲波處理10 min后定容至10 ml, 經(jīng)離心(轉(zhuǎn)速2500 r/min)處理10 min, 取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾, 備用。

2.3 專屬性試驗 分別取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液, 按“2.1”項下色譜條件進樣, 結(jié)果見圖1。由圖可知,各峰分離度良好, 供試品具有與對照品色譜圖相對應的色譜峰, 而陰性樣品在相應位置無色譜峰, 對檢測亦無干擾。

圖1 HPLC圖

2.4 線性關系考察 精密吸取白藜蘆醇對照品溶液, 以50%甲醇水溶液為溶劑, 配置系列濃度溶液, 按“2.1”項下色譜條件分別進樣, 記錄峰面積。以白藜蘆醇質(zhì)量濃度(C)為橫坐標, 峰面積(A)為縱坐標, 進行線性回歸, 得回歸方程A=161401 C-47615(r=0.9997, n=6)。結(jié)果表明, 白藜蘆醇在1.0～81.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

精密吸取綠原酸對照品溶液, 以50%甲醇水溶液為溶劑,配置系列濃度溶液, 按“2.1”項下色譜條件分別進樣, 記錄峰面積。以綠原酸質(zhì)量濃度(C)為橫坐標, 峰面積(A)為縱坐標, 進行線性回歸, 得回歸方程A=47998C+87671(r=0.9996, n=6)。結(jié)果表明, 綠原酸在9.60～307.20 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別精密量取兩種對照品溶液連續(xù)進樣, 各6次, 記錄峰面積。經(jīng)計算得, 綠原酸峰面積值的RSD=0.58%(n=6)；白藜蘆醇峰面積值的RSD=0.43%(n=6), 結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 分別精密稱取同一批號樣品適量, 各6份, 按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液, 按“2.1”項下色譜條件檢測。結(jié)果表明, 樣品中綠原酸的RSD=0.80%(n=6),白藜蘆醇的RSD=1.93%(n=6), 表明本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 分別精密量取供試品溶液適量, 于0、2、4、8、12、24 h, 按“2.1”項下色譜條件檢測。結(jié)果表明, 綠原酸的RSD=0.76%(n=6), 白藜蘆醇的RSD=1.83%(n=6), 表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率 分別稱取已知白藜蘆醇和綠原酸含量的樣品6份, 每份1.0 g, 置于容量瓶中, 分別精密加入適量白藜蘆醇和綠原酸的對照品溶液, 混勻后按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液, 按“2.1”項下色譜條件檢測, 計算回收率。見表1。

2.9 樣品測定 分別稱取批號為121128、121212、121213三批供試樣品適量, 按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件檢測, 記錄峰面積, 結(jié)果。見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長選擇 通過紫外掃描知, 綠原酸在327 nm 處有最大吸收, 白藜蘆醇在305 nm 處有最大吸收, 但白藜蘆醇在327 nm 處吸收比較小, 而綠原酸在305 nm 處有較好吸收,為保證兩待測組分能同時較好地被檢測, 故選擇305 nm作為檢測波長。

3.2 處理溶劑選擇 由于白藜蘆醇難溶于水, 故樣品前處理中分別考察了采用乙腈、乙醇、甲醇與水的混合溶液作為稀釋液對含量測定的影響。實驗中發(fā)現(xiàn), 采用乙腈水溶液處理, 造成綠原酸含量測得值偏低；用乙醇水溶液處理, 綠原酸對照液出現(xiàn)兩個峰, 白藜蘆醇的峰形不對稱；采用甲醇水溶液處理, 僅發(fā)現(xiàn)綠原酸對照液出現(xiàn)小峰, 經(jīng)調(diào)整甲醇與水的比例后(即甲醇：水=1∶1, V/V)小峰消失。故選擇50%甲醇水溶液進行樣品和對照品的處理。

3.3 超聲波處理時間的考察 樣品前處理中, 分別考察了經(jīng)超聲波處理10、20、30 min對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明,經(jīng)不同時間的超聲波處理后, 樣品測定結(jié)果無顯著差異, 故只需選擇超聲波提取處理10 min即可。

3.4 流動相的篩選 本研究分別考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液, 以及不同磷酸的量對分離效果的影響。結(jié)果表明, 采用流動相甲醇-磷酸水溶液, 綠原酸的峰形不好, 平均對稱因子為0.56, 而白藜蘆醇峰形較好, 平均對稱因子為1.01, 通過調(diào)整磷酸的量, 綠原酸的峰形依舊無法改進。而采用流動相乙腈-磷酸水溶液, 綠原酸的峰形較好但出現(xiàn)小峰, 通過調(diào)整磷酸濃度至0.4%時, 小峰消失, 各待測組分保留時間適宜, 重現(xiàn)性好, 無拖尾現(xiàn)象。分析原因為綠原酸是有機酸, 在酸性流動相中可減少其電離狀態(tài), 而保持峰形穩(wěn)定, 分離度好[4,5], 故確定以乙腈-0.4%磷酸水體系為流動相。

綜上所述, 本研究建立的HPLC可同時測定肝甦顆粒中綠原酸和白藜蘆醇的含量, 操作簡便、靈敏、重現(xiàn)性良好,因此可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。但同時也發(fā)現(xiàn)肝甦顆粒中白藜蘆醇的含量明顯偏低, 可能是由于提取過程中的水煎煮工藝尚不能較完全提取出虎杖中的有效成分, 提示原有的提取工藝有待進一步的改進與完善。

[1]童珊珊, 徐亞萍, 金花, 等.綿茵陳提取液中綠原酸的測定及其抗氧化活性研究.江蘇中醫(yī)藥, 2009, 41(4):57-59.

[2]夏玲紅, 金冠欽, 孫黎, 等.車前草的化學成分與藥理作用研究進展.中國藥師, 2013, 16(2):294-296.

[3]施翠英, 鄧放, 任波.應用HPLC法探究虎杖瀉心湯中蒽醌類成分的含量. 中國藥房, 2012, 23(11):1010-1012.

[4]陶君彥, 張曉昱, 黃志軍, 等. HPLC 法同時測定木瓜中綠原酸、咖啡酸的含量.中國藥房, 2007, 18(12):912-914.

[5]張雯麗, 孫冬曉, 董立華. RP-HPLC法同時測定金錢草和廣金錢草中綠原酸、槲皮素和山柰酚的含量.西北藥學雜志, 2013, 28(5):486-488.

Simultaneous content determination of resveratrol and chlorogenic acid by HPLC in Gansu granules

HUANG De-fu. Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350025, China

ObjectiveTo establish simultaneous content determination method of resveratrol and chlorogenic acid in Gansu granules.MethodsHigh performance liquid chromatography(HPLC) was applied, with chromatographic column as WondaSil C18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm), mobile phase as acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution (25∶75, V/V), flow velocity as 1.0 ml/min, determine wavelength as 305 nm, column temperature as 25℃, and sample volume as 20 μl.ResultsResveratrol in content of 1.0～81.0 μg/ml had good linear relation with its peak area (r=0.9997), and its average standard recovery rate was 100.5% (RSD=2.42%, n=6). Chlorogenic acid in content of 9.6～307.2 μg/ml had good linear relation with its peak area (r=0.9996), and its average standard recovery rate was 99.7% (RSD=2.06%, n=6).ConclusionThis method is accurate and repeatable, and it can be applied in quality control of Gansu granules.

High performance liquid chromatography; Gansu granules; Chlorogenic acid; Resveratrol; Content determination

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.18.212

2015-06-04]

350025 福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院