順鉑聯合氟西汀對肺癌伴抑郁小鼠干預的研究

李密輝，吳曉，魏凱，林燕華，魏穎，孫婧，羅清莉，劉寶君，董競成

(復旦大學附屬華山醫院，上海 200040)

腫瘤疾病作為一個重大的生活應激事件對患者心理有著很大的影響。有研究表明，腫瘤患者抑郁發病率為15% ～29%，是正常人患病率的3 ～5倍［1］。并且腫瘤治療本身會增加患者患抑郁癥的風險［2］。情感應激可降低腫瘤患者的生活質量、影響治療效果并且會增加致死率［3］。研究顯示，抑郁平均會使腫瘤患者生存期下降10% ～20%左右，一項為期17年的前瞻性研究結果表明，癌癥的死亡率和抑郁情緒密切相關，高度抑郁者的死亡率是非抑郁者的2 倍［4］。因此，腫瘤與抑郁相伴發生有著密切的病理生理關系。

本研究通過建立小鼠肺癌伴抑郁模型，使用抗抑郁藥物氟西汀聯合化療藥順鉑對其進行干預，通過觀察抑郁及腫瘤相關指標的改善情況，評價其療效并探討其作用的內在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級C57BL/6J 小鼠(簡稱“C57 小鼠”)40只，雄性，7 周齡，體重20 ～24 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供【SCXK(滬)2012-0002】。SPF 級CD1 小鼠30 只，雄性，9 ～10月齡退役種鼠，體重35～40 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0036】。動物飼養于復旦大學藥學院實驗動物中心【SYXK(滬)2010-0099】;Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)細胞株惠贈于復旦大學附屬中山醫院;小鼠鼠籠帶孔有機塑料擋板;社交接觸曠場(42 cm × 42 cm × 42 cm);Noldus 動物行為學視頻跟蹤系統(Ethovision XT8.5，復旦大學上海醫學院腦科研究院提供);皮質醇試劑盒:德國LDN 公司產品;IL-6 試劑盒美國R＆D 公司產品;抗VEGE 抗體英國Abcam 產品;抗NF-κB 抗體美國CST 產品;鹽酸氟西汀膠囊:蘇州禮來制藥有限公司產品;注射用順鉑:山東齊魯制藥有限公司產品。

1.2 小鼠社交應激性抑郁及腫瘤模型的建立

社交應激小鼠均采取單籠飼養，造模方法參考文獻［5－6］，首次應激開始前將攻擊性較強的CD1 小鼠放置于透明擋板一側24 h;將C57 小鼠放置CD1同側社交應激4 ～5 min，之后將C57 放置于透明擋板另一側，使之能觀察到CD1 并能嗅到對方氣味，相處24 h 后，開始下一輪應激;連續應激10 d，10 d之中CD1 小鼠位置不變，C57 小鼠每天變換鼠籠，使之不遇到同一只CD1 小鼠，應激結束后進行社交接觸行為學實驗。(2)腫瘤組小鼠均在社交應激結束后于右前肢腋后側皮下接種2 ×106個LLC 細胞。

1.3 實驗分組及處理

1.3.1 動物分組

將40 只C57 小鼠隨機分為正常對照組(正常組，10 只);肺癌伴抑郁模型組(模型組，10 只);模型+順鉑組(單藥組，10 只);模型+順鉑+氟西汀組(雙藥組，10 只)。正常組小鼠正常飼養;模型組應激結束后接種LLC 細胞，生理鹽水灌胃0.3 mL/d，共14 d，種瘤后每3 天1 次腹腔注射生理鹽水每次0.2 mL，共4 次;單藥組社交應激結束后接種LLC 細胞，生理鹽水灌胃0.3 mL/d，共14 d，種瘤后每3 天1 次腹腔注射順鉑2 mg/kg，共4 次;雙藥組社交應激結束后接種LLC 細胞，氟西汀20 mg/kg 灌胃，共14 d，種瘤后每3 天1 次腹腔注射順鉑2 mg/kg，共4 次。正常組小鼠5 只每籠，接受社交應激小鼠單籠飼養，自由進食飼料與水，室溫20 ～25℃，相對濕度50% ～70%，光暗周期12 h。

1.3.2 小鼠行為學觀察

10 d 社交應激結束后，采用社交接觸實驗對小鼠行為學進行評價，實驗分為兩個150 s，第一個150 s 期間CD1 小鼠不在曠場之內，將C57 小鼠放置于社交接觸曠場中，曠場一側為透明有孔有機玻璃圍墻;中間間隔30 s，在30 s 內將C57 小鼠從曠場轉移到飼養鼠籠內，同時將未與該C57 小鼠有社交應激接觸的CD1 小鼠放入到圍墻內，同時將C57再次放入到社交曠場內，記錄下一個150 s 內C57小鼠在曠場內的運動軌跡［5］。

1.3.3 血清標本收集

接種腫瘤第15 天，所有小鼠眼眶動脈采血，4℃靜置2 h 后，3000 r/min，4℃離心15min，上清液－80℃保存，ELISA 方法檢測血清中皮質醇及IL-6 水平，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 RT-PCR 方法檢測海馬組織中腦源性神經營養因子(brain derived neurotropic factor，BDNF)mRNA 表達

取血后將小鼠置于冰上，頸后部開顱，分離海馬組織，迅速投放入液氮中，實驗結束后放入－80℃冰箱凍存待測。用Trizol 試劑盒對海馬組織中總RNA進行提取，將提取出的mRNA 進行逆轉錄，合成cDNA 模板，以cDNA 為模板進行PCR 擴增。引物序列，BDNF 上游引物:5’GAG GTC TGA CGA CGA CAT CAC 3’，下游引物:5’GCT CCA AAG GCA CTT GAC TG 3’;β-actin 上游引物:5’CCT CTA TGC CAA CAC AGT 3’;下游引物:5’AGC CAC CAA TCC ACA CAG 3’。總反應體系為20 UI，反應過程為:95℃5 min;95℃5 s;60℃30 s(40 個循環)，以β-actin 為內參，進行吸光度比值分析，以此代表目的基因的表達水平。

1.3.5 免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中NF-κB與VEGF 表達

小心剝離皮下腫瘤組織并稱重，將其置于4%多聚甲醛中進行固定，用石蠟包埋切片，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1.5 h，DBA 顯色3 ～5 min，鏡下觀察，陽性產物呈棕黃色或黃色。

1.4 統計學分析

實驗數據采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，資料以均數±標準誤表示(sˉx);符合正態分布和方差齊性，資料采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊采用秩和檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 社交應激行為學評價

末次社交應激結束24 h 后對各組小鼠進行社交接觸曠場實驗，CD1 小鼠未出現時各組小鼠在社交區活動時間差異無顯著性(P ＞0.05);CD1 小鼠出現后，接受過社交應激三組小鼠在社交區活動時間明顯低于正常組(P ＜0.05);各組自身比較，正常組小鼠在CD1 出現后表現出更為活躍的社交水平，在社交區停留時間明顯延長，而接受社交應激的各組小鼠則表現出社交回避行為，在社交區停留時間較CD1 未出現時明顯下降(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠在CD1 小鼠出現前后在社交區停留時間Fig.1 The stay time in the interaction zone of mice of all groups before and after CD1 mice presence

2.2 血清皮質醇及IL-6 水平變化

與正常組比較，模型組血清皮質醇及IL-6 水平明顯升高(P ＜0.05);單藥組血清皮質醇及IL-6 水平與模型組相比有降低趨勢但差異無顯著性(P ＞0.05);而雙藥組與模型組比較皮質醇及IL-6 水平明顯下降，差異有顯著性(P ＞0.05)。見圖2。

2.3 海馬組織BDNF mRNA 表達

圖2 各組小鼠血清皮質醇與IL-6 水平比較Fig.2 The levels of serum cortisol and IL-6 in the mice of all groups

使用RT-PCR 方法檢測海馬組織中BDNF mRNA 表達，與正常組比較，模型組小鼠海馬組織BDNF mRNA 表達水平下降(P ＜0.05);單藥組與模型組比較差異無顯著性(P ＞0.05);雙藥組與模型組和單藥組比較BDNF mRNA 表達明顯升高(P ＜0.05)。見圖3。

2.4 各組皮下腫瘤重量與模型組比較

單藥組和雙藥組皮下腫瘤重量明顯降低，差異具有顯著性(P ＜0.05);單藥組與雙藥組相比差異無顯著性(P ＞0.05)。見圖4。

圖3 各組小鼠海馬BDNF mRNA 表達水平Fig.3 BDNF mRNA expression levels in the hippocampus of mice in all groups

2.5 腫瘤組織中NF-κB 及VEGF 蛋白表達

與模型組相比，單藥組和雙藥組腫瘤組織中NFκB 及VEGF 表達水平明顯降低(P ＜0.01);單藥組與雙藥組比較差異無顯著性(P ＞0.05)。見圖5，6。

圖4 各組小鼠皮下腫瘤重量Fig.4 Tumor weight of the mice in all groups

圖5 各組皮下腫瘤組織NF-ΚB 與VEGF 免疫組化平均吸光度值Fig.5 The IOD of NF-ΚB and VEGF in tumor tissues determined by immunohistochemical staining.

3 討論

抑郁與腫瘤關系密切，許多臨床研究發現應激、慢性抑郁、社會支持和心理因素可能影響腫瘤的發生及進展，其主要機制可能為各種應激性因素激活下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經系統兩條信號級聯途徑啟動應激反應［7］。本實驗通過社交失敗應激誘導C57 小鼠建立社交應激性抑郁模型，該模型被認為是應激誘導抑郁相關情緒較為可靠的模型，與人類抑郁癥的若干行為學和神經生物學改變具有相似性［8］。通過社交接觸曠場實驗評價小鼠行為學，發現遭受社交應激失敗的各組小鼠比正常組小鼠在社交區停留時間明顯縮短，這種社交回避行為在CD1 小鼠出現以后更加明顯，而正常組小鼠則表現出更為活躍的社交水平，實驗結果表明重復性的暴露于社交失敗應激因素之下，會導致抑郁樣表型，表現為社交回避行為［9］。研究表明，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA 軸)在抑郁癥的發病機制中發揮著重要作用［10］。在抑郁患者當中，HPA 軸被激活，腎上腺分泌大量糖皮質激素，導致血液中糖皮質激素水平升高。亦有研究報道急性應激能夠使小鼠體內糖皮質激素升高［11］。而糖皮質激素可使某些腫瘤細胞抵抗凋亡并且下調機體的免疫反應，這可能有助于腫瘤發生轉移［12］。我課題組前期研究亦證實給予社交應激能夠促進腫瘤生長［13］。研究發現IL-6 與抑郁和腫瘤的進展有較為明確的相關性，腫瘤伴抑郁患者血清IL-6 水平較不伴抑郁腫瘤患者明顯升高［14，15］。本實驗中肺癌伴抑郁模型組小鼠血清皮質醇及IL-6 水平較正常組明顯升高，也印證這一觀點。經氟西汀和順鉑藥物治療的雙藥組皮質醇和IL-6 水平較模型組則明顯下降，單藥組皮質醇及IL-6 水平經治療后也有下降但較模型組差異不顯著。說明抗抑郁與抗腫瘤治療均能降低血清中炎癥因子IL-6 水平，但單純抗腫瘤治療不能改善HPA軸紊亂狀態，經氟西汀治療后，皮質醇及IL-6 水平明顯降低。臨床研究發現氟西汀能夠降低重度抑郁患者血清皮質醇水平，調節HPA 軸紊亂狀態，且多種抗抑郁藥物具有抗炎作用，可改善抑郁患者血清IL-6 升高狀況［16，17］。

圖6 各組小鼠腫瘤組織NF-κB 與VEGF 蛋白表達(×200)Fig.6 Expression of NF-κB and VEGF in the tumor tissue of mice in all groups (×200)

BDNF 在抑郁癥發病機制及治療過程中有著重要的作用，本實驗中模型組小鼠海馬BDNF mRNA表達與正常組比較明顯降低，經氟西汀治療后雙藥組小鼠BDNF mRNA 表達較模型組和單藥組明顯升高，差異有顯著性。抑郁癥發病學說之一就是腦內BDNF 的缺乏，而腦內BDNF 水平升高可能會起到抗抑郁效果［18，19］。研究發現抑郁模型小鼠存在海馬區神經元凋亡伴BDNF 表達水平下降，而外源性BDNF 微量注入大鼠中腦、海馬和側腦室可有效緩解抑郁癥大鼠的類抑郁行為［20，21］。本實驗表明口服氟西汀能夠增強抑郁小鼠海馬組織BDNF mRNA表達，從而發揮其抗抑郁作用，而單純抗腫瘤治療則并無此作用。

單藥組及雙藥組小鼠皮下腫瘤重量、腫瘤組織NF-κB 及VEGF 表達與模型組比較明顯降低，雙藥組與單藥組比較有下降趨勢但差異無顯著性，表明氟西汀抗抑郁治療并未對腫瘤的發展起到明顯抑制作用。NF-κB 是一類普遍存在的轉錄調節因子，研究發現其可通過多種細胞因子的轉錄而發揮抗凋亡、促進細胞增殖、血管發生、腫瘤轉移的作用［22］。VEGF 是目前已知的作用最強的促血管形成因子之一，它可以通過促進血管生成從而參與肺癌浸潤與轉移。而NF-κB 與VEGF 有著密切的聯系，在腫瘤血管形成中NF-κB 起著核心作用，它通過上調VEGF 的表達促進腫瘤血管的形成［23］。而NF-κB與抑郁癥也有著密切的聯系，文獻報道慢性社交孤立導致的氧化或硝化應激可能是通過激活NF-κB及增加誘導型一氧化氮合成酶表達實現的，文獻報道大多數抗抑郁藥物有著抗炎效果［24，25］。本實驗設想NF-κB 可能為抑郁與腫瘤相互作用的交互點之一，是否氟西汀可以通過抑制NF-κB 產生抗炎效果從而對腫瘤有抑制作用，然而通過氟西汀與順鉑聯合治療與順鉑單藥治療進行對比，雙藥組與單藥組相比腫瘤重量及相關蛋白表達雖有一定的下降趨勢，但無統計學差異。分析可能為抗抑郁藥物治療時間較短，并且抑郁可通過多途徑、多靶點促進腫瘤發生、發展與轉移［7］。氟西汀為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，能夠增加突觸間隙5-羥色胺水平從而產生抑郁作用，而具體可能機理有增加海馬BDNF水平、促進神經類固醇合成等［26］。

綜上所述，本研究未發現氟西汀對NF-κB 有明顯的抑制作用，因此可能并未起到對腫瘤抑制作用。但服用氟西汀小鼠抑郁相關指標有明顯改善，因此臨床腫瘤伴抑郁病人服用氟西汀能夠起到抗抑郁改善生活質量的目的。但抗抑郁藥物能否對腫瘤有抑制作用，還需更多基礎及臨床試驗進行驗證。

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