恒河猴P21基因在COS-7細胞中沉默位點的驗證

李雨函，蘇靜芬，張晨，石亮，劉云波

(1．中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021;2．北京大學生命科學學院，北京 100871)

與目前廣泛使用的嚙齒動物相比，非人靈長類動物在生理、發育、行為、免疫以及基因背景與人類更加相近。在藥物研發和安全性評價中，為減少嚙齒動物與人類基因背景的差距所帶來的不穩定性和局限性，非人靈長類已成為重要的腫瘤研究和藥物評價的實驗動物［1］。

雖然一直有非人靈長類自發神經、消化道等腫瘤的報道，但因發生率較低難以用其自發腫瘤作為研究模型［2］。此外，在研究中由于非人靈長類動物個體間基因背景差異明顯，對統計的分析要求較復雜，明顯的個體基因差異也影響研究結果的分析和解釋。因此，利用癌癥相關基因和基因工程技術建立和發展非人靈長類腫瘤模型動物為癌癥機制的研究和抗癌藥物研發以及臨床前實驗服務具有重要意義［3］。

P21Waf1/Cip1/Sdi1(文中簡稱P21)是細胞周期素依賴性激酶抑制因子，屬于CIP 家族。P21 具有廣泛的CDK 抑制活性，因其作用于細胞周期減少受損DNA 的復制和積累，發揮抑癌作用，長期以來被認為具有抑制腫瘤的功能。近些年對P21 的研究發現在Trp53－/－和Atm－/－小鼠自發性淋巴瘤中P21 并沒有抑制腫瘤的發生，因此有提出在特定的細胞環境和條件下P21 有可能是致癌基因［4，5］。P21 在癌癥發生和發展中的功能非常重要，而其作用并不完全清楚。為利于以后建立相應基因沉默動物模型、深入研究P21 在腫瘤發生及發展中的作用和功能，本研究從細胞水平篩選并確定了恒河猴P21 基因的沉默靶點，為進一步探討P21 的功能作用奠定細胞水平的基礎研究。

1 材料和方法

1.1 材料

COS-7 購自中國醫學科學院基礎研究所細胞中心，Vero，Vero-E6 購自ATCC 細胞庫。含有ubiquitin promoter (Ubi promoter)調控的紅色熒光蛋白tandem dimer tomato(tdt)報告基因的FUGW-TDT 慢病毒載體由北京大學實驗室保存。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶為Invitrogen-Gibco 公司產品。細胞培養基DMEM 購自Hyclone;質粒提取試劑盒購自Promega;逆轉錄試劑盒購自Invitrogen;PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司;E．coli DH5α 感受態細胞購自全式金公司;鼠抗猴P21 單克隆抗體，購自Santa Cruz公司;HRP 標記的羊抗鼠-HRP 購自Sigma;PCR 檢測引合成及測序均由Invitrogen 公司提供;β-actin抗體購自上?？党缮?Xho I 和Xba I 購自NEB。

1.2 shRNA 的設計

Life technology 在線shRNA 設計工具，根據NCBI 數據庫中恒河猴 P21 基因的序列(NM _00194722.2)，依照shRNA 設計原則，選擇五個靶點設計shRNA 序列(序列見表1)。靶點均與非洲綠猴P21 基因同源。設計網址為(http://rnaidesigner．lifetechnologies．com/rnaiexpress/setOption．do?designOption=shrna＆pid=261946071111563135)。

1.3 P21-RNA 干擾慢病毒載體的構建和鑒定

載體構建參考文獻［6］。用Xho I 和Xba I 對FUGW-TDT 載體進行酶切消化，經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收、純化后備用。載體與需要導入的shRNA 按比例混合16℃過夜連接后轉化至E．coli DH5α 中，37℃培養后挑取單菌落培養后進行 菌 液鑒 定 及測序(引物均為F:5’-AGGAAGATGGCTGTGAGG-3’;R:5’-GCCTTGTATCGTATAAGC-3’，提取陽性克隆菌液質粒，命名為 FUGW-TDTP21shRNA。本實驗的陰性對照為未導入shRNA 的空載FUGW-TDT 空質粒。

1.4 細胞培養與慢病毒質粒轉染

用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養液在37℃，5% CO2培養箱中常規培養上述細胞。在六孔板中按每孔(6 ～8)×105細胞種細胞，24 h 內細胞密度達70% ～80%時進行轉染。實驗分空載質粒組(陰性對照)和FUGW-TDT-shP21 質粒組。其中質粒組分別為四個針對不同靶點設計的質粒。轉染按照Polyethylenimine (PEI)試劑說明操作，48 h后觀察熒光。

1.5 RT-PCR 檢測各組細胞中mRNA 的表達

收集各組細胞按照Invitrogen Trizol Reagent 說明書分別提取細胞總RNA，測量其濃度后按試劑盒說明進行逆轉錄和PCR。P21 基因引物為F:5’-CGAAGTCAGTTCCTTGTGGG-3 ’， R: 5 ’-CATTAGCGCATCACAGTCGC-3’預計擴增出188 bp 左右的目的片段。內參GAPDH，其引物序列參考文獻［7］，F:5’- ACATCATCCCTGCCTCTACTG-3’，R:5’AGTGGGTGTCGCTTTGAAGTC-3’，預計擴增出261 bp 左右的目的片段。PCR 反應程序:94℃預變性2 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環，72℃延伸10 min。

1.6 Western blot 檢測各組細胞中P21 蛋白的表達

轉染細胞48 h 后棄掉細胞培養液、吸凈殘液，加入預冷的1 × PBS 沖洗兩次后加入1 × SDS 裂解液，均勻吹打細胞后收集裂解產物，高速離心后收取上清測定總蛋白濃度。SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳用8% 的分離膠以及4%的積層膠，總蛋白上樣量為20 μg。轉膜后加鼠抗猴P21 單克隆抗體(1∶1000)封閉液4℃孵育過夜，1 × PBS 充分洗膜后加入HRP 標記的羊抗鼠IgG(1∶5000)封閉液孵育3 h，曝光、顯影后用Image J 軟件進行灰度掃描分析。

1.7 統計分析

進行方差齊性檢驗后采用Fisher 檢驗，P ＜0.05認為差異有顯著性。

2 結果

2.1 恒河猴P21 基因沉默靶點和shRNA

Life technology 在線設計shRNA 序列，在恒河猴P21mRNA 中的位置見表1。

表1 恒河猴P21 基因沉默靶點Tab．1 The sites of P21 gene silencing in the rhesus monkeys

2.2 細胞中P21 豐度的檢測

選取Vero、Vero-E6、COS-7 三種細胞提取RNA后逆轉錄為cDNA，普通PCR 后電泳檢測P21 豐度(圖1)。結果顯示三種細胞P21 的豐度均較高，但實驗中COS-7 比Vero、Vero-E6 更易轉染，因此本研究室優先選取COS-7 用于基因抑制效率檢測。

圖1 P21 細胞豐度檢測Fig．1 Detection of the P21 abundance

2.3 檢測轉染細胞中P21 基因mRNA 的表達

轉染48 h 后提取RNA，RT-PCR 檢測P21 mRNA 在COS-7 細胞中的表達，trizol 法提取RNA，逆轉錄后進行real-time PCR，按2-ΔΔCt法進行計算。與空載 FUGW-TDT 質粒相比，四個靶位點在P21mRNA 水平的沉默效率均明顯(P ＜0. 05)，其中FUGW-TDT-P21shRNA-1 的沉默效率為(91.82±3.21)%，FUGW-TDT-P21shRNA-2 的沉默效率為(82.47±2.48)%，FUGW-TDT-P21shRNA-3 的沉默效率為(81.31±2.69)%，FUGW-TDT-P21shRNA-4的沉默效率為(87.35±4.59)%(圖2)。

圖2 SYBR-Green 法real-time PCR 檢測P21 基因mRNA 的表達Fig．2 Detection of P21mRNA by real-time PCR

2.4 FUGW-TDT shRNA 對cos-7 細胞中P21 蛋白表達的抑制作用

Western blot 檢測COS-7 細胞中P21 的表達量，結果顯示P21 shRNA 轉染的細胞P21 蛋白的表達量較對照組明顯減少。經圖像軟件進行灰度分析，其中FUGW-TDT-P21shRNA-1 轉染后細胞P21 表達量為(11.97±0.70)%，FUGW-TDT-P21shRNA-2 轉染后細胞P21 表達量為(20.22±0.65)%，FUGWTDT-P21shRNA-3 轉染后細胞P21 表達量為(23.21± 0.63)%，FUGW-TDT-P21shRNA-4 轉染后細胞P21 表達量為(14.42± 0.86)% (圖3)。Western blot 顯示的結果和real-time PCR 保持一致，四個靶位點在P21 蛋白水平的沉默效率明顯。

圖3 Western Blot 檢測COS-7 細胞中P21 蛋白的表達量Fig．3 Detection of P21 protein by Western blot．

3 討論

在CDKN1A－/－小鼠發生自發性腫瘤是P21 首次從基因學證明其具有抑癌作用，雖然人類的直腸癌、宮頸癌、腦頸部癌癥、肺癌等大多數癌癥的發展都與P21 的表達相關，但并沒有證明CDKN1A 的變異使P21 的功能完全喪失，但可以說明P21 在抑癌作用中發揮著重要作用，和其他一些抑癌因子共同調節抑制腫瘤發生和惡化［8］。P21 與腫瘤 的分化、浸潤深度、增生和轉移有關，具有判斷預后的價值。

現有研究發現在特定條件下P21 的錯誤調控和表達也會致癌。在人類前列腺癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌都有P21 過量表達，雖然沒有直接證據證明P21 過量表達與癌癥直接相關，或是此類發現有可能是受到化療和放療的影響，但P21 是致癌基因的理論在少量基因小鼠的研究中已被發現［4，9］。

本研究中real time PCR 和Western blot 分析RNA 干擾的COS-7 細胞中P21 mRNA 水平和蛋白表達量均比對照組顯著降低，且二者結果一致，有助于建立P21 沉默的恒河猴模型。

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