基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物學基礎

陳申秒，吳雪莉

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司山東濱州256600；2.山東博萊威生物技術研究所山東濱州256606；3.南京農業大學草業學院江蘇南京210095）

基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物學基礎

陳申秒1，2，吳雪莉3

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司山東濱州256600；2.山東博萊威生物技術研究所山東濱州256606；3.南京農業大學草業學院江蘇南京210095）

基因Ⅶ型新城疫已成為我國禽業養殖中的主要新城疫類別，在商品肉雞和蛋雞養殖臨床中成為防治重點，本文從基因Ⅶ型新城疫病毒的分子生物學基礎上進行分析，結合生產實踐，為養殖一線制定切實可行的防治措施提供比較有價值的參考。

基因Ⅶ型；新城疫病毒；分子生物學

雞新城疫病毒(New castle disease virus,NDV)屬于副黏病毒科，腮腺炎病毒屬的單股負鏈RNA病毒，是危害養禽業最重要的傳染性病毒之一，被OIE列為A類疫病。受養殖環境、免疫壓力和生物安全措施等各種因素的影響，雞新城疫病毒成為最常見，同時也是防控難度最大、問題最多的疫病之一。全世界曾多次發生新城疫的大流行，研究認為目前處于NDV的第四次大流行期，流行病學研究證實本次流行是由基因Ⅶ型NDV引起的，在亞洲、非洲和歐洲等地區的研究確定為基因Ⅶd亞型引起，雖然沒有出現世界性的全面大流行，但局部地區，特別是我國，出現大面積的免疫蛋雞群產蛋率下降，肉雞群高死亡率的情況，損失嚴重。

1 NDV毒力鑒定及基因型研究

根據對NDV全基因組的遺傳進化分析，NDV只有一個血清型，但可以分為ClassⅠ和ClassⅡ2個不同分支。ClassⅠ型被認為是無毒株或弱毒株，ClassⅡ型包括了基本所有的疫苗毒株，從臨床分離的致病毒株基本都是ClassⅡ型，按照F蛋白可將每個群分成9個不同的基因型。其中Ⅰ～Ⅳ型和Ⅴ～ⅤⅢ型基因組長度不同，分別為15 186 nt、15 192 nt。其中目前所用的疫苗毒株Lasota、clone30、N79等毒株均為基因Ⅱ型，當前被國內外學者認為處于NDV的第四次大流行，其主要病原為基因Ⅶ型NDV。

判定NDV強、弱毒的有傳統的生物學特性鑒定法和分子生物學鑒定法。對NDV分離株測定，6周齡靜脈接種指數（IVPI）、1日齡腦內接種指數（ICPI）、雞胚最小致死量（MDT）是用于判定NDV毒力的生物學指標，孫靜等對山東分離株NDV強毒株測定的MDT、ICPI、IVPI分別為47.4h、1.975、2.85[1]。分子生物學方法研究證實，NDV的毒力與F蛋白的氨基酸序列直接相關，強、弱毒株在氨基酸裂解位點上截然不同，F蛋白 112-117氨基酸序列為112R-RQ-K/R-R-F117、112G-R/K-Q-G-R-L117兩種[2]，可作為判定分離毒株毒力的生物學標準，目前國內分離毒株強毒的確認均采用F蛋白112-117氨基酸序列作為分子生物學判定方法。

很多學者建立了其他分子生物學診斷方法來區分NDV強、弱毒株，主要是RT-PCR、熒光RT-PCR鑒別技術。陳安莉等參照NDV強、弱毒株F基因序列及其F基因的保守序列設計了3套LAMP引物，可以根據擴增結果來區分NDV強、弱毒株[3]，可供參考使用；殷俊磊等利用F基因保守區建立了雛雞體內NDV強毒的熒光定量RT-PCR檢測方法[4]。分子生物學方法可用于實驗室檢測，但準確率和可重復性需要進一步驗證，耗時長、技術和設備要求高，對臨床常規檢測意義不大，因此并不適合于養殖一線的普通實驗室使用。建立快速簡便、準確、可重復性高的檢測技方法，特別是應當開發易于操作的試劑盒，對基層獸醫服務有很大的幫助，對GeneⅦ的監測和防治意義重大。

基因型的分類依據F基因的研究，研究發現在F基因334～1 682 nt之間限制性內切酶HinfⅠ、BstoⅠ和RsaⅠ位點分布的不同，通過3種酶切位點的差異用于NDV基因型的鑒定[5]。根據F基因47～435 nt序列推導的核苷酸序列繪制系統進化樹，所反映的毒株之間的進化關系與限制性酶切位點分布所分析得出的結論是一致的，所以酶切位點分布分析的方法和F基因序列的系統進化樹均可進行NDV的基因型的鑒定。2002年至今，對國內NDV的分子流行病學研究多是采用F序列的同源性及進化關系，揚州大學、國家新城疫參考實驗室等公布的總計200多株強毒分離株96%以上屬于基因Ⅶ型。

2 基因Ⅶ新城疫病毒毒力變化的分子生物學研究

不同基因型NDV的基因組大小略有不同，Ⅴ～ⅤⅢ型基因組15 192 nt，由融合蛋白(F)、血凝素神經氨酸酶(HN)、核衣殼蛋白（NP）、基質蛋白(M)、磷蛋白(P)和大分子蛋白(L)6種結構蛋白組成[6]，其結構蛋白構成模式為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′。HN蛋白和F蛋白是研究最為深入的蛋白，研究認為HN蛋白與受體結合，介導F蛋白與細胞膜的融合，兩者是和NDV毒力最為相關的結構蛋白，是NDV主要的致病因子[7]。

對F蛋白多肽裂解位點的研究發現，基因Ⅶ型強毒株F蛋白序列出現不同的基因點突變，有些突變為共同的突變點，也出現了分離株不一致的突變點；強毒株的標志為多肽裂解位點（F1和F2多肽裂解位點）的變化。據報道，從山東分離基因Ⅶ型強毒株，多肽裂解位點為112-RRQKRF-117，F基因核苷酸同源性與基因Ⅶ型雞源毒株同源性在93.5%～98.3%，而與經典強毒株F48E9和Lasota株的核苷酸和氨基酸同源性卻都比較低[1]；張會娟等對2株分離株全基因序列比對發現，與Genbank公布的29株基因Ⅶ型強毒株核酸序列同源性為91%～97%，與中國標準強毒F48E8同源性僅85%[8]。有報道發現了69、78兩個位置的不同點突變，這些點突變與分離株的生物學毒力有很大關系，對于基因Ⅶ型毒株新的變異方向也具有很大研究價值。根據F基因推導的氨基酸序列出現了特異的殘基替換，根據楊少華等研究，其推導的Ⅶ型F蛋白氨基酸序列發現了Ⅶd中Ⅰ52-V、Ⅶa、Ⅶc和Ⅶd中R101-K和A176-S氨基酸替換[9]；山東地區Ⅶd分離株的報道中也發現存在Q279-H和K387-R的氨基酸殘基替換；同時F蛋白功能區也存在高度保守的糖基化位點和氨基酸殘基，這與可能與F蛋白介導細胞膜融合，參與NDV對細胞的侵蝕性具有相關性，但保守的糖基化位點和氨基酸殘基及其功能需要進一步確定，來自上海地區的研究報道了基因Ⅶ型強毒株之間RE位點分布的變化。需要注意的是基因Ⅶ型分離株在1 249 nt的RsaⅠ位點是其他亞型NDV沒有的，在鵝源NDV分離株的研究中常見該酶切位點的報道，楊少華等所分離的3個毒株基因Ⅶd型毒株與報道的鵝源及鴨源NDV分離株之間核苷酸序列具有非常高的同源性，揭示鴨源、鵝源NDV與雞源NDV在遺傳學和流行病學上密切相關[9]。這些提示對NDV的研究要重視不同來源的重組帶來的F基因的序列變化。

HN蛋白兼有血凝素和神經氨酸酶的活性，負責病毒粒子與其細胞受體的起始吸附和受體破壞活性，在免疫反應中作用極為突出。HN蛋白的球狀區分布了所有單克隆抗體能夠識別的神經氨酸酶活性位點、受體結合位點和抗原位點[10]，對NDV侵蝕性和逃避免疫的影響重大。HN蛋白的七肽重復序列(Heptad repeat region,HR)，可以能形成α螺旋，進而與F蛋白的相關區域形成的超螺旋具有改變F蛋白構象的功能[9]。HN蛋白受體結合關鍵區域在193-201、494、513-521、569、345-353位氨基酸位點，這些區域或其相近區域的氨基酸序列變化對毒株與單抗的反應性具有根本性的變化，疫苗株的203、342、394-395、508-509、514、570位氨基酸在基因Ⅶ型NDV分別突變為組氨酸（H）、天冬酰胺（N）、天冬氨酸和谷氨酸（E）、天冬酰胺和異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸（R）。研究認為關鍵性位點的改變決定了單克隆抗體抗原決定簇的空間構象，從而導致了與單抗反應性的改變[11]。國內學者研究還發現在強毒株的HN蛋白線性表位345-352aa處，出現347位氨基酸由E-K（G）的變化，77位氨基酸由天冬酞胺（N）突變為絲氨酸（S），這種變化導致了病毒與單抗的反應性降低，對于病毒對免疫的逃避具有很大的作用，這與免疫壓力下的病毒變異應當具有很大的關系。

其他蛋白在NDV的毒力和生物學特性上的功能也在研究當中，目前已經發現另外四種結構蛋白、RNA編輯機制形成的W蛋白和V蛋白在NDV的致病機制中發揮了作用[12]，在NDV蛋白結構及其相互作用機制方面還有很多有待于深入研究的地方，這些蛋白的變化、及相互協同性對NDV毒力的影響和遺傳變化需要進一步核實。

3 基因Ⅶ新城疫防控的關鍵和前景

免疫壓力必然導致NDV的變異，出現的強毒株能夠逃避傳統疫苗的免疫，其物學特性、及分子生物學上的變化的研究是解決NDV免疫的關鍵，如上述病毒與單克隆抗體反應性的降低，氨基酸序的替換等均能導致疫苗免疫后不能形成有效地保護[8]。從分子學角度，疫苗毒株均屬于基因Ⅱ型，與強毒基因Ⅶ型分離株遺傳關系遠，基因組同源性僅82%左右。基因Ⅶ型NDV引起不同日齡產蛋雞群發生產蛋大幅下降的情況，肉雞群中同樣可以分離到大量的新城疫強毒株。流行病學調查顯示，這些雞群均經新城疫油佐劑苗多次免疫，具有較高的HI抗體水平，抗體均一度良好。筆者在臨床中也多次發現產蛋雞群免疫NDV油佐劑滅活苗后雞群ND HI抗體水平達1∶64以上，仍不能有效抵抗ND強毒株的感染的情況。部分認為雞群缺乏局部免疫抗體（黏膜免疫IgA）造成感染，但根據很多規模化雞場系統的免疫程序和臨床監測，可以確定NDV的變異造成了新城疫發生，即使很高的抗體，流行毒株和疫苗抗體之間的差異最終不能對基因Ⅶ型NDV形成有效防護。

不僅雞源NDV強毒的變化，水禽分離株變化同樣應引起高度重視，國內外報道的雞源NDV分離株、基因Ⅶ型NDV分離株中Ⅶa、b、c、d和e亞型之間也有很多不同的氨基酸替換或其他方面的突變，前面已經詳述，而國內的研究發現從鵝群分離到的基因Ⅶc亞型出現了1 249 nt RsaⅠ位點，這在其他NDV分離株上未見報道，所以懷疑新出現的很多具有較高致病力的NDV分離毒株很有可能來源于水禽，這些毒株與傳統的Clone30、Lasota、CS2和V4疫苗株相比發生了很大的遺傳改變，親緣關系也比較遠。同時根據臨床經驗，在雞群免疫體系的壓力普遍高于水禽，即水禽有可能成為NDV逃避免疫并產生新城疫變異毒株棲身場所，因此，應密切關注生產中NDV抗原性的變化，對基因Ⅶ型NDV做好病毒生物學的良好監測。

在疫苗研究中Cho等用流行株F、HN替換Lasota已經獲得了致弱的重組毒株，并制備了滅活疫苗，與Lasota滅活苗相比產蛋率提高10%[13]；我國農業部畜禽傳染病學實驗室同樣獲得了基因Ⅶ型致弱毒株，毒力符合弱毒株標準，且不能造成細胞病變，致弱株制備活疫苗、滅活疫苗與Lasota相比均具有很大優勢，能有效降低動物排毒率，顯著減少泄殖腔病毒含量。從生產臨床中看，新城疫的排毒是需要解決的問題，各種致弱毒株的臨床效果需要進一步的驗證，同時解決抗體檢測中與Lasota的區別，對使用過程中病毒分子生物學的變化應當加以檢測，避免重組出現的返祖、不同來源病毒的重組和出現更強毒株等問題，同時考慮從流行的代表性毒株篩選候選疫苗株配合常規疫苗免疫，控制NDV的排毒，才能真正有效的控制強毒NDV的流行。

在現在NDV基因Ⅶ型發生率高的情況下，關鍵是做好NDV的基礎免疫，本實驗室通過大量的田間試驗，建議肉雞免疫以活疫苗免疫配合滅活苗免疫為主，有條件的可以通過母源抗體測定確定免疫日齡，選擇弱毒疫苗配合滅活疫苗注射；蛋雞免疫關鍵是建立系統的免疫程序，在1～60日齡以活疫苗做好基礎免疫，配合滅活疫苗提高抗體水平，同時關注法氏囊等免疫抑制病對NDV疫苗的影響，在開產強要高度重視滅活疫苗的使用，可選擇具有針對基因Ⅶ型防治的滅活疫苗，確保產蛋高峰期來臨之前具有很高的抗體水平，在開產以后定期補免新城疫、禽流感二聯滅活疫苗。■（編輯：狄慧）

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Immunological and Biological Basis of GenotypeⅦNewcastle Disease Virus

Chen Shenmiao1，2，Wu Xueli3
（1.Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.,Ltd,Binzhou Shandong,256606; 2.Shandong Binzhou Bilaiwei Biological Technology Institute,Binzhou Shandong,256606；3.College of prataculture science,Nanjing Agricultural University,Nanjing Jiangsu,210095）

GenotypeⅦNewcastle disease has become the main Newcastle disease in China poultry breeding in the category,has become the focus in commercial broiler and laying hens in the clinical prevention,this paper carries on the analysis from the basis of molecular biology of Newcastle disease virus,combining with production practice,provide more valuable preventive measures for the breeding line.

GenotypeⅦ;Newcastle disease virus;Biological

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.01.032

陳申秒，男，（1983-），山東菏澤鄆城人，助理研究員，碩士，從事動物傳染病的診斷與防治工作，E-mail：csmiao.science@163.com。