基于T-RFLP技術的拙政園土壤微生物多樣性分析

吳瓊，陳紫丹，邱業先

（蘇州科技學院化學生物與材料工程學院，江蘇蘇州215009）

基于T-RFLP技術的拙政園土壤微生物多樣性分析

吳瓊，陳紫丹，邱業先*

（蘇州科技學院化學生物與材料工程學院，江蘇蘇州215009）

采集拙政園3個底泥和3個土壤樣品，運用末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）技術分析拙政園6個樣品的微生物多樣性。研究結果顯示：底泥細菌中T-RFs片段大小為181 bp、211 bp的菌種為優勢菌種，土壤細菌中T-RFs片段大小為91 bp、205 bp的菌種為優勢菌種。各樣點底泥的真菌種類各不相同，且種類較少，無明顯的優勢菌種，而土壤真菌中T-RFs片段大小為355 bp的菌種為優勢菌種。這說明拙政園底泥、土壤的細菌和真菌多樣性存在差異，細菌多樣性明顯高于真菌。為蘇州園林微生物多樣性及群落結構累積了有價值的資料。

拙政園；微生物多樣性；末端限制性片段長度多態性；底泥；土壤

拙政園始建于明正德初年，占地約5.2 hm2，距今已有500多年歷史，1961年被國務院列為全國第一批重點文物保護單位，是江南古典園林的代表作品之一。1997年拙政園被列入《世界遺產名錄》。近年來，拙政園的游客接待量屢創新高，這一現象對拙政園的生態環境產生嚴重影響，但對其微生物生態變化鮮有研究報道。末端限制性片段長度多態性（Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技術，可用微生物基因組不同長度DNA片段代表不同類型的微生物，顯示的峰高或峰面積一定程度上代表了該種微生物類型片段的豐度[1]。T-RFLP技術作為一種研究微生物群落多態性的方法被越來越多的運用在環境微生物研究中。該技術因其可重復性高、周期短、高通量等特點[2]被廣泛運用于環境微生物群落結構及變化等生態學研究中，比如海洋[3]、土壤[4]等。

廣義上土壤包括了土壤以及底泥。底泥微生物包括細菌、古菌、真菌、病毒、原生動物和顯微藻類，是湖泊等水體沉積物中一切看不見或者看不清楚的微小生物的總稱[5]。底泥微生物是水體生態系統物質循環和能量流動的主要動力，底泥中微生物物種、基因等資源的鑒定和獲得有助于豐富當前對微生物資源的認知，有助于從側面了解水質演化歷史[6]。土壤是生態系統的重要組成部分，是微生物棲息的大本營。土壤物質組成、理化過程和微環境的高度異質性，導致土壤被認為是地球上“微生物多樣性”最豐富的環境[7]。因此，要研究拙政園生態系統的多樣性和群落結構，對土壤微生物的研究是必不可少的。然而環境中大部分微生物不能通過傳統的純培養獲得，只有運用宏基因組學的方法繞過純培養來研究環境微生物多樣性與群落結構。因此，筆者采用T-RFLP等技術針對拙政園水系底泥、土壤中細菌、真菌的多樣性及群落結構展開研究，旨在了解拙政園土壤微生物多樣性，為環境監測預警和評價提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

DNA抽提試劑盒、Taq PCR Master Mix、DNA膠回收試劑盒購自上海生工；EDTA-Na2、溴化乙錠等均為國產分析純。

1.1.2 儀器

小型臺式高速離心機（5417R，德國Eppendorf），凝膠成像分析儀（Universal Hood II，美國Bio-Rad PCR擴增儀5332），德國Eppendorf恒溫水浴鍋（HH·S21-4-S，上海精宏）。

1.2 方法

1.2.1 采樣

樣本于2014年3月28日采自江蘇省蘇州市拙政園，選擇了6個地點采樣，分別采集各樣點的底泥和土壤。底泥采用取樣器取自湖泊支干、中心及主干的河道，土壤取自園內樹根、空地、草根周圍的土壤。湖泊底泥用采樣器取湖泊0-10 cm底泥，土壤采集表層土，深度為0-5 cm，充分混勻裝入塑料封口袋，避光儲存，帶回實驗室進行分析。

1.2.2 DNA提取和PCR擴增

DNA提取：采集的各樣品用基因組DNA抽提試劑盒（上海生工，SK8263）提取總DNA，經1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外成像均出現明亮條帶。將提取的DNA在-20℃的條件下保存待用。PCR擴增：采用針對細菌16SrRNA的特異性引物FAM-27F和1495R進行PCR擴增，其中27F的5‘端用熒光標記。引物序列為：FAM-5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’[8]。采用真菌ITS區通用引物ITS1-F和ITS4，其中ITS1-F的5’端用熒光標記，引物序列為：FAM-5’-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3’，5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[9]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。細菌PCR反應體系為：12.5 μL 2×Taq Master Mix，9.5 μL ddH2O，Primer1（27F）、Primer2（1492R）和模板DNA各1 μL。真菌PCR反應體系為：10 μL 2×Taq Master Mix，6 μL ddH2O，3 μL模板DNA（稀釋50倍），Primer1（ITS1-F）和Primer2（ITS4）各0.5 μL。

細菌PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環，72℃延伸10 min，4℃保存；真菌PCR：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共40個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應程序為擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA膠回收試劑盒（上海生工，SK8131）進行割膠純化，純化產物經1%瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測。

1.2.3 T-RFLP分析

采用HhaⅠ（上海生工，FD1854）和HaeⅢ（上海生工，ER0151）兩種限制性內切酶雙酶切細菌PCR產物。采用HhaⅠ（上海生工，FD1854）限制性內切酶酶切真菌。PCR產物。然后，37℃下溫浴1 h，80℃下處理20 min使酶失活。最后將酶切產物送至上海基康生物技術有限公司進行基因掃描。

1.3 數據分析

所有樣品的T-RFLP圖譜用Peak Scanner Software v1.0軟件進行分析，選擇的內標是500-250liz和sizing defalt-pp，去除片段大小小于50 bp或大于500 bp和熒光強度小于50熒光單位（FU）峰面積低于總峰面積0.5%的T-RFs[10]。峰值圖上峰所對應的橫坐標代表T-RF的片段長度，縱坐標代表含有熒光物質T-RF的熒光強度；峰面積則代表具有相同片段長度的T-RF熒光強度之和，即它所代表的該菌種的相對數量[11]。物種豐度（Species Richness）為：S=T-RFLP圖譜中顯著峰的總數。由于每一種細菌的T-RF長度是唯一的，所以粗略地認為每個峰對應著一個不同的物種。多樣性指數包括豐度香農指數（Shannon index）、辛普森指數（Simpson index）、均勻度指數（Evenness index）[12]，用SPSS19.0進行聚類分析，根據公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）計算樣品之間Sorenson的相似性系數，其中N（A+B）指兩樣品共有的部分，NA、NB指兩樣品各自包含的部分。

2 結果與分析

2.1 拙政園底泥、土壤細菌的PCR擴增結果分析

以提取的拙政園6個樣點的底泥、土壤的基因組DNA為模板，分別采用針對細菌16SrRNA的特異性引物、真菌ITS區通用引物進行擴增，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1、圖2。細菌獲得了長度約為1 500 bp的目的條帶，真菌獲得了長度約為600 bp和1 000 bp的目的條帶。

圖1 底泥、土壤16srRNA細菌的PCR電泳圖

圖2 底泥、土壤16srRNA真菌的PCR電泳圖

2.2 拙政園底泥、土壤的T-RFLP分析

利用HhaⅠ和HaeⅢ兩種限制性內切酶雙酶切拙政園底泥、土壤細菌PCR產物，HhaⅠ酶切真菌PCR產物，T-RFLP分析結果見圖3、圖4。從圖3可以看出酶切譜帶明顯，細菌的T-RFs片段大小在56-330 bp之間。真菌的T-RFs片段大小在51-380 bp之間，底泥、土壤細菌、真菌群落均存在差異。表1、表2列出了底泥、土壤細菌T-RFs長度及其優勢長度，與圖3、圖4結果一致，即峰面積較大的為優勢類群。細菌的數量表現為：支干底泥＞主干底泥＞中心底泥，空地土壤＞草根土壤＞樹根土壤；真菌的數量表現為：中心底泥＞主干底泥＞支干底泥，樹根土壤＞草根土壤＞空地土壤，結果表明各系統群落呈現出多樣性。

圖3 底泥、土壤細菌的T-RFLP圖譜

圖4 底泥、土壤真菌的T-RFLP圖譜

表1 基因組DNA檢測細菌T-RFs長度

表2 基因組DNA檢測真菌T-RFs長度

2.3 拙政園底泥、土壤微生物多樣性分析

拙政園底泥、土壤細菌、真菌的香農多樣性指數、辛普森指數、均勻度指數見表3、表4。由表3可知，各樣點細菌香農指數在3.119-3.486之間，辛普森指數在0.926-0.963之間，均勻度指數在0.864-0.945之間，各指數相差不大，說明拙政園各樣點細菌多樣性均勻且多樣性較高。表4是真菌群落的多樣性指數，對應的香農指數、辛普森指數均低于細菌，真菌多樣性不高，均勻度也存在差異。這一結果說明底泥中可能以厭氧菌居多，真菌種類較少，多樣性較低。

表3 底泥、土壤細菌群落的多樣性指數

表4 底泥、土壤真菌群落的多樣性指數

2.4 拙政園底泥、土壤微生物相似性分析

拙政園底泥、土壤細菌、真菌群落相似性系數見表5、表6。細菌群落相似性系數在0.091-0.517之間，真菌群落相似性系數在0-0.489之間。細菌中，支干底泥和中心底泥相似性系數最高，為0.517；其次是空地土壤和草根土壤，為0.330；再次為支干底泥和空地土壤，為0.263。總體上底泥細菌相似性高于土壤細菌相似性，原因在于底泥與上覆水之間存在交換作用，各樣點底泥微生物之間交互流動，是一個整體系統，微生物多樣性比較一致。而各樣點土壤空間上是分隔開來的，微生物多樣性會存在較高差異。真菌中，底泥的真菌種類較少，相似性幾乎沒有。在土壤中，真菌相似性在0.005-0.489之間，存在一定相似性。樹根土壤與草根土壤相似性最高，原因在于其環境相似，存在的菌種也具有相似性。

表5 底泥、土壤細菌群落相似性系數

表6 底泥、土壤真菌群落相似性系數

3 討論與結語

拙政園作為蘇州園林的典型代表之一，為世人所喜愛。近年來，隨著氣候、游客量等客觀因素的影響，其生態環境及微生物種群等受到一定的影響。但國內外均未見相關的研究報道。筆者首次采用T-RFLP技術分析拙政園底泥和土壤的細菌、真菌多樣性與群落結構。

T-RFLP技術因重復性、高通量等優勢，在微生物多樣性研究中發揮重要作用。如Trabelsi D等[13]采用TRFLP技術研究了菜豆接種根瘤菌對土壤細菌群落的影響。Scavino A F等[14]運用T-RFLP技術研究了烏拉圭牧場和灌溉稻田的土壤中產甲烷微生物群落的結構和功能。雖然T-RFLP技術在微生物多樣性研究中廣泛應用，但目前未發現在園林環境微生物研究方面中采用T-RFLP技術。

該研究采用T-RFLP技術分析了拙政園底泥、土壤6個采樣點的細菌、真菌多樣性與菌落結構。6個采樣點之間微生物多樣性與群落結構存在差異，不同采樣點的底泥、土壤微生物多樣性與群落結構也不相同。細菌中，支干底泥優勢T-RFs長度為205 bp、211 bp、213 bp、231 bp，中心底泥優勢T-RFs長度為181 bp、183 bp、197 bp、211 bp，主干底泥優勢T-RFs長度為181 bp、191 bp、206 bp、209 bp，底泥中181 bp、211 bp分別是兩個樣點的優勢菌種，表明拙政園湖泊底泥的優勢菌種為181 bp、211 bp所代表的菌種。樹根土壤優勢T-RFs長度為176 bp、179 bp、189 bp、192 bp，空地土壤優勢T-RFs長度為91 bp、205 bp、210 bp、231 bp，草根土壤優勢T-RFs長度為59 bp、91 bp、205 bp、233 bp。真菌中，支干底泥優勢T-RFs長度為268 bp、269 bp；中心底泥優勢T-RFs長度為273 bp、380 bp，主干底泥優勢T-RFs長度為320 bp、348 bp，樹根土壤優勢T-RFs長度為327 bp、355 bp，空地土壤優勢T-RFs長度為92 bp、355 bp，草根土壤優勢T-RFs長度為341 bp、355 bp。底泥各樣點的真菌種類各不相同，土壤中T-RFs片段大小為355 bp的菌種為優勢菌種。各樣點細菌多樣性指數相差不大且都比較高，說明拙政園各樣點細菌有豐富的多樣性。其中草根土壤的細菌各項多樣性指數均為最高，表明草根周圍土壤營養豐富，適于細菌生存，環境最優。各樣點真菌的香農指數、辛普森指數都比較低，且都低于同一樣點的細菌多樣性指數，表明真菌多樣性不高，均勻度差異也較大。這一現象的原因可能是底泥中氧含量常年較低，以厭氧菌居多，真菌種類較少；而土壤中細菌多樣性高于真菌是由于土壤中細菌數量占土壤微生物總量的70%到90%，土壤是各種微生物生活的大本營，據估計1 g土壤中有4 000-7 000種近10億的細菌，生物量可達300-30 000 kg·hm-2[15]，這一結果與以往的研究結果是吻合的。該研究對分析蘇州園林微生物多樣性和群落演替累積了重要資料。

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T-RFLP analysis of soil microbial diversity in Humble Administrator's Garden

WU Qiong，CHEN Zidan，QIU Yexian
（School of Chemistry，Biology and Material Engineering，SUST，Suzhou 215009，China）

Terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)technique was used to analyze microbial diversity in 3 points of sediment and 3 points of soil in Humble Administrator's Garden.The results show that among the sediment bacteria，T-RFs fragments with the sizes of 181 bp，211 bp were the dominant bacteria.A-mong soil bacteria，T-RFs fragments with the sizes of 91 bp，205 bp were the dominant bacteria.Among sediment fungi，species of each site were not identical.Among soil fungi，T-RFs fragment with the size of 355 bp was the dominant fungus.Bacterial and fungal diversity of sediment and soil in Humble Administrator's Garden were different.Bacterial diversity was significantly higher than that of fungi.This study has provided valuable data for microbial diversity and community structure of Suzhou gardens.

Humble Administrator's Garden；microbial diversity；T-RFLP；sediment；soil

Q33

A

1672－0687（2015）03－0036－07

責任編輯：李文杰

2015－01－23

吳瓊（1990-），女，江蘇泰州人，碩士研究生，研究方向：生物催化轉化。

*通信聯系人：邱業先（1954-），男，教授，博士，碩士生導師，E-mail：qyx542@163.com。