α硫辛酸后處理對膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響及機制

李國福，趙陽，朱孟杰，秦含玉，臧彬

（中國醫科大學附屬盛京醫院ICU，沈陽 110004）

·論著·

α硫辛酸后處理對膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響及機制

李國福，趙陽，朱孟杰，秦含玉，臧彬

（中國醫科大學附屬盛京醫院ICU，沈陽 110004）

目的探討α硫辛酸（ALA）后處理對膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響及其可能機制。方法32只雄性SD大鼠隨機分成4組：正常對照組（A組）、ALA后處理對照組（B組）、膿毒癥組（C組）和膿毒癥聯合ALA后處理組（D組）。A、B 2組均行假手術，C、D 2組行盲腸結扎穿孔術（CLP）復制膿毒癥模型。B、D 2組大鼠術后立即給予ALA 200 mg/kg灌胃。24 h后檢測大鼠血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6-）及白細胞介素1β（IL-1β）水平，腎組織行PAS染色觀察病理學改變，免疫印跡法測定NF-κB相關蛋白表達。結果膿毒癥可以誘發腎臟病理學改變，與A組相比，C組SCr和BUN含量分別增加了178%和66%（P＜0.01），TNF-α、IL-6及IL-1β水平分別增加55%、114%和110%（P＜0.01）；同時NF-κB p65的磷酸化水平（144%）和細胞核內的表達（102%）顯著增加（P＜0.01），并IκBα的表達下降61%（P＜0.01）。早期給予ALA可以明顯改善上述變化，與C組相比，D組SCr和BUN含量分別下降了48%和26%（P＜0.05），TNF-α、IL-6及IL-1β水平分別降低25%、37%和40%（P＜0.05）；同時NF-κB p65的磷酸化水平和細胞核內的表達顯著減少41%和49%（P＜0.05），IκBα的相對表達水平增加103%（P＜0.05）。結論ALA抑制NF-κB的活化，從而改善膿毒癥相關急性腎損傷。

急性腎損傷；α硫辛酸；膿毒癥；核轉錄因子-κB

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應綜合征，常導致休克甚至多器官衰竭，是臨床危重癥最主要的死亡原因之一。盡管臨床上針對重癥膿毒癥的醫療技術在不斷改善，但全球每天仍有約14 000人死于其并發癥［1，2］。膿毒癥急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是最常見、最嚴重的膿毒癥并發癥，發病率高達50%，死亡率高達70%，是膿毒癥患者死亡的最主要原因，但目前仍無有效的治療手段［3］。α硫辛酸（α-lipoic acid，ALA）是一種公認的強抗氧化劑，在多種疾病的研究中已顯示出益處。Cadiric等［4］報道ALA能減弱盲腸結扎和穿孔（caecal ligation and puncture，CLP）誘導的膿毒癥大鼠的急性肺損傷并降低死亡率。但ALA在膿毒癥相關腎損傷中是否具有保護作用未見相關報導。本研究擬評估ALA對膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康雄性SD大鼠32只，由中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗中心提供，［SCXK（京）2009-0004］，體質量200～250 g。隨機分為4組：正常對照組（A組，n=8）、ALA后處理對照組（B組，n= 8）、Sepsis組（C組，n=8）及Sepsis聯合ALA后處理組（D組，n=8）。本實驗經中國醫科大學動物實驗倫理委員會批準，實驗方法和目的符合人類道德倫理標準和國際慣例。

1.2 模型建立及藥物處理

大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥位四肢固定于手術臺上。行腹正中切口，逐層分離皮膚、腹膜。進入腹腔，將腸道推向一側，找到盲腸。采用經典的CLP方法復制大鼠膿毒癥模型。找到盲腸后，結扎盲腸末端1/2，在結扎的盲腸末端用12號針頭穿2個孔，并結扎腸系膜動脈，在盲腸末端留置4號手術線1根，打活結，可見被結扎的盲腸立即缺血變色，術畢分層縫合關腹。造模結束后，B、D 2組大鼠立即給予ALA 200 mg/kg灌胃。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 血清肌酐（SCr）及尿素氮（BUN）測定：CLP后24 h處死大鼠，心臟取血，常溫下1 500 r/min離心10 min，留取上清，按照試劑盒說明書操作，苦味酸法測定SCr，二乙酰肟法測定BUN含量。

1.3.2 腎臟病理組織學檢測：取腎組織1 mm3置10%甲醛中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切成5 μm薄片，行PAS染色，光鏡下觀察。

1.3.3 血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）及白細胞介素1β（IL-1β）水平測定：全血標本離心取血清，按照試劑盒說明書，ELISA法測定相關指標水平。

1.3.4 Westen blot方法分析NF-κB相關蛋白表達：取各組大鼠腎組織，組織裂解液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，1%Triton，0.2 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，2 mmol/L Aprotinin）裂解組織提取蛋白。蛋白定量后，40 μg上樣蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，70 V恒壓轉膜2.5 h后，將PVDF膜以5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，分別加入NF-κB抗體（1∶100）、p-p65抗體（1∶100）和IκBα抗體（1∶100），4℃孵育過夜。HRP標記的相應二抗（1∶5 000）37℃孵育45 min，化學發光（ECL）試劑顯色。凝膠圖像處理系統分析目標條帶的光密度值，以β-actin和Lamin A為內參進行標化處理。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組SCr、BUN水平變化

A、B 2組均行假手術，B組給予ALA后與A組相比SCr、BUN無明顯變化；而C組造模后24 h SCr、BUN水平與A組相比有明顯升高，分別增加178%和66%，差異具有統計學意義（P＜0.01）；早期給予ALA處理可使SCr、BUN明顯降低，與C組相比，D組SCr、BUN含量分別下降48%和26%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SCr、BUN測定結果Tab.1 Results of SCr and BUN in different groups

2.2 腎臟組織病理學變化

A、B 2組大鼠的腎小管微絨毛和基底層有廣泛的PAS陽性區域，表明腎臟組織具有完整的結構。而C組的形態學改變以刷狀緣缺失、腎小管變性及皮質小管空泡形成為特征。早期給予ALA，即D組可以減慢CLP手術24 h后的這些病理改變的進展。見圖1。

2.3 各組TNF-α、IL-6及IL-1β測定結果

C組TNF-α、IL-6及IL-1β水平與對照組相比明顯升高，分別增加55%、114%和110%，差異均具有統計學意義（P＜0.01），早期給予ALA處理即D組可使TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯降低，與C組相比分別下降25%、37%和40%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 腎組織PAS染色 ×200Fig.1 PAS staining of kidney×200

表2 各組TNF-α、IL-6及IL-1β測定結果Tab.2 TNF-α、IL-6 and IL-1β results in different groups

2.4 NF-κB相關蛋白表達變化

CLP手術后24 h，與A組相比，C組腎組織中NF-κB p65的磷酸化及細胞核表達顯著增加，IκBα的表達水平明顯降低。NF-κB p65和p-p65的相對表達量分別增加了102%和144%，IκBα的相對表達水平降低了61%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。早期給予ALA處理即D組可以明顯減少NF-κB p65在細胞核中的表達及其磷酸化水平，并恢復IκBα的表達水平。與C組相比，D組NF-κB p65和p-p65的相對表達量分別降低了49%和41%，IκBα的相對表達水平增加了103%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 腎組織IκBα、p-p65和NF-κB p65的表達Fig.2 Relative expression of IκBα，p-p65 and NF-κB p65 in the kidney

3 討論

膿毒癥是AKI的常見病因，在ICU中大約有35%到50%的AKI是由于膿毒癥引起的［5］。CLP誘導膿毒癥模型已被廣泛地用于研究預防和治療膿毒癥的新藥物，它能夠模擬人體疾病的病變特點以及病程［6，7］。本實驗結果顯示，CLP可以誘發實驗大鼠腎臟明確的組織病理學損傷，術后早期給予ALA處理，明顯改善了膿毒癥導致的腎損傷。此外，早期的ALA處理亦顯著抑制了炎性因子在血清中的表達，并且抑制了膿毒癥大鼠腎組織中激活了的NF-κB通路，提示ALA對抗膿毒癥導致腎損傷的可能保護機制。

ALA已被臨床試驗和體內研究證實是安全有效的。Cremer等［8］給大鼠灌胃ALA的LD50大于2 000 mg/kg。本研究中使用ALA 200 mg/kg給大鼠灌胃，結果表明，早期給予ALA處理降低了CLP術后膿毒癥的死亡率，降低了血清Cr和BUN水平，并減弱腎的組織損傷。ALA在本研究中觀察到的有益作用，與先前研究結果［9］ALA具有針對不同的急慢性腎病的明顯的保護作用相一致。因此，本研究不僅進一步證明了ALA對于膿毒癥相關多器官功能障礙的治療效果，同時也表明，未來對ALA治療潛力的深入研究將是值得的。

研究發現血液中TNF-α在炎性反應或內毒素休克時出現較早，并迅速達到高峰，從而誘發“次級”細胞因子如IL-1β、IL-6及趨化因子IL-8等的產生［10，11］。大量炎性因子的釋放引起毛細血管的通透性增加，血中白細胞增多、滲出、聚集，最終導致全身炎性反應綜合征（SIRS）。多種炎性介質的釋放及其所導致的SIRS或抗炎性反應綜合征，是促進休克惡化甚至發展為多器官功能不全綜合征及引起死亡的重要因素之一［12］。本研究發現，在大鼠CLP造模之后，血清中TNF-α，IL-6和IL-1β的增加被早期給予ALA顯著抑制。這些數據表明，ALA減少CLP術后釋放的炎性因子，減輕腎損傷，提高生存率。

NF-κB是一個重要的轉錄因子，抑制NF-κB活性可使膿毒性休克時的促炎性因子的產生減少，從而減少多器官衰竭的發生并降低病死率［13，14］。臨床上，在急性炎癥和膿毒癥患者中，NF-κB與DNA結合活性增強，并與臨床嚴重程度以及致死率相關［15］。而抑制NF-κB通路在預防或治療人類疾病中是必不可少的［16，17］。這些發現促使我們研究ALA是否減少CLP模型中NF-κB在腎組織中的活化。本研究中，CLP術后大鼠腎組織中的NF-κB p65的磷酸化及細胞核表達顯著增加，早期的ALA處理顯著抑制了NF-κB的活化。這表明ALA在抗氧化，阻止炎性疾病發生發展的治療效果可能與抑制NF-κB活化有關。

本研究仍有一些局限性。各組動物的數目相對較少，可能增加統計數據的偏倚；其次，研究只關注了CLP手術后24 h的腎組織變化，并且ALA在其他時間點是否有類似的益處還有待進一步研究。

綜上所述，ALA后處理在CLP手術誘導的膿毒癥大鼠中，減輕急性腎損傷，其可能機制是通過減少炎性因子的釋放和抑制NF-κB的活化。

［1］Fry DE.Sepsis，systemic inflammatory response，and multiple organ dysfunction：the mystery continues［J］.Am Surg，2012，78（1）：1-8.

［2］Dombrovskiy VY，Martin AA，Sunderram J，et al.Rapid increase in hospitalization and mortality rates for severe sepsis in the United States：a trend analysis from 1993 to 2003［J］.Crit Care Med，2007，35（5）：1244-1250.

［3］Holthoff JH，Wang Z，Patil NK，et al.Rolipram improves renal perfusion and function during sepsis in the mouse［J］.J Pharm Expe Thera，2013，347（2）：357-364.

［4］Cadirci E，Altunkaynak BZ，Halici Z，et al.Alpha-lipoic acid as a potential target for the treatment of lung injury caused by cecal ligation and puncture-induced sepsis model in rats［J］.Shock，2010，33（5）：479-484.

［5］孟廣蕊，李春盛.腎損傷分子-1對于膿毒癥相關腎損傷的早期預測價值［J］.首都醫科大學學報，2012，33（3）：394-398.

［6］Hubbard WJ，Choudhry M，Schwacha MG，et al.Cecal ligation and puncture［J］.Shock，2005，24（Suppl 1）：52-57.

［7］Doi K，Leelahavanichkul A，Yuen PS，et al.Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury［J］.J Clin Invest，2009，119（10）：2868-2878.

［8］Cremer DR，Rabeler R，Roberts A，et al.Safety evaluation of alphalipoic acid（ALA）［J］.Regul Toxicol Pharmacol，2006，46（1）：29-41.

［9］Veljkovic AR，Nikolic RS，Kocic GM，et al.Protective effects of glutathione and lipoic acid against cadmium-induced oxidative stress in rat's kidney［J］.Ren Fail，2012，34（10）：1281-1287.

［10］何雙雙，林春水，古妙寧，等.鹽酸戊乙奎醚對失血性休克-內毒素二次打擊大鼠腎損傷的保護作用［J］.南方醫科大學學報，2011，31（5）：899-902.

［11］Walley KR，Lukacs NW，Standiford TJ，et al.Balance of inflammatory cytokines related to severity and mortality of murine sepsis［J］. Infect Immun，1996，64（11）：4733-4738.

［12］Huang W，Tang Y，Li L.HMGB1，a potent proinflammatory cytokine in sepsis［J］.Cytokine，2010，51（2）：119-126.

［13］Collins T，Read MA，Neish AS，et al.Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules：NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers［J］.FASEB J，1995，9（10）：899-909.

［14］Liu SF，Malik AB.NF-kappa B activation as a pathological mechanism of septic shock and inflammation［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，290（4）：L622-645.

［15］Arnalich F，Garcia-Palomero E，Lopez J，et al.Predictive value of nuclear factor kappa B activity and plasma cytokine levels in patients with sepsis［J］.Infect Immun，2000，68（5）：1942-1945.

［16］Ying Z，Kampfrath T，Sun Q，et al.Evidence that alpha-lipoic acid inhibits NF-kappa B activation independent of its antioxidant function［J］.Inflamm Res，2011，60（3）：219-225.

［17］Yoo TH，Lee JH，Chun HS，et al.alpha-Lipoic acid prevents p53 degradation in colon cancer cells by blocking NF-kappa B induction of RPS6KA4［J］.Anticancer Drugs，2013，24（6）：555-565.

（編輯 裘孝琦）

Efficacy ofα-Lipoic Acid Treatmenton Sepsis-induced Acute Kidney Injury in Ratsand Its Mechanisms

LIGuo-fu，ZHAOYang，ZHUMeng-jie，QIN Han-yu，ZANGBin
（DepartmentofCriticalCare Medicine，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the impact of α-lipoic acid（ALA）treatment on sepsis-induced acute kidney injury in rats and explore the mechanisms.MethodsA total of 32 male SD rats were randomized into 4 groups：normal control group（group A），ALA-treated control group（group B），sepsis group（group C）and sepsis with ALA treated group（group D）.Group A and B underwentsham operation，while CLP operations were conducted in group C and D.Rats in both group B and group D were then administered with 200 mg/kg ALA by oral gavage immediately after the surgicalprocedure.Twenty-fourhours afterthe surgicalprocedure blood sampleswere obtained forthe evaluation ofcreatinine，BUN，TNF-α，IL-6 and IL-1β.Ratkidneys were rapidly removed forPAS stain.Western blotwas employed to determine the expression ofNF-κB.ResultsPathologicalchanges ofkidney were induced by sepsisand the levelofcreatinine，BUN，TNF-α，IL-6 and IL-1βwere significantly increased by 178%，66%，55%，114%and 110%（P＜0.01）.respectively；simultaneously the phosphorylation and nuclear expression of NF-κB p65 in kidney tissues were significantly increased by 144%and 102%（P＜0.01）.Sepsis-induced acute kidney injury also significantly reduced the expression of IκBα by 61%（P＜0.01）.These changes were significantly suppressed by early ALA treatment.Compared with C group，the level of creatinine，BUN，TNF-α，IL-6 and IL-1β were significantly decreased by 48%，26%，25%，37%and 40%（P＜0.05），respectively，and the relative expression of IκBα was increased by 103%（P＜0.05）.ConclusionThe present study demonstrated that ALA can suppress the activation of NF-κB，thus ameliorating sepsis-related acute kidney injury.

acute kidney injury；α-lipoic acid；sepsis；NF-κB

R692.5

A

0258-4646（2015）07-0557-04

國家自然科學基金（81471847）；遼寧省自然科學基金（2014021003）；沈陽市科學技術項目計劃（F14-158-9-40）

李國福（1968-），男，教授，博士.

E-mail：ligf@sj-hospital.org

2014-12-15

網絡出版時間：