二硫蘇糖醇提取純化Cavl.2鈣通道片段CT3蛋白

孫宇，封瑞，楊磊，毛楠，胡慧媛，孫雪菲，郝麗英

（1.中國醫科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122；2.天津出入境檢驗檢疫局工業品中心，天津 300300）

·論著·

二硫蘇糖醇提取純化Cavl.2鈣通道片段CT3蛋白

孫宇1，封瑞1，楊磊2，毛楠1，胡慧媛1，孫雪菲1，郝麗英1

（1.中國醫科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122；2.天津出入境檢驗檢疫局工業品中心，天津 300300）

目的探討二硫蘇糖醇（DTT）有助于PreScission蛋白酶切除重組蛋白GST-CT3標簽GST的方法。方法在大腸埃希菌BL21中轉化入pGEX-6P-3/CT3重組質粒并誘導其表達，用B-PER提取純化重組蛋白GST-CT3，在10 mmol/L DTT存在的情況下PreScission蛋白酶切除GST標簽得到高濃度的CT3蛋白，進行SDS-PAGE電泳鑒定CT3蛋白。結果不含DTT情況下，PreScission蛋白酶很難切除重組蛋白GST-CT3的標簽蛋白GST，而在10 mmol/L DTT存在的情況下，PreScission蛋白酶能夠切除重組蛋白GST-CT3的標簽蛋白GST，得到高濃度的CT3蛋白。結論10 mmol/L DTT有助于PreScission蛋白酶切除重組蛋白GST-CT3的標簽蛋白GST，得到高濃度的CT3蛋白。

重組蛋白；心肌細胞；鈣通道

L型鈣離子通道是存在于心肌細胞上的主要鈣通道。L型鈣通道電流參與心肌動作電位平臺期的形成與維持，鈣離子（Ca2+）通過L型鈣通道進入心肌細胞，從而觸發鈣，誘發鈣釋放引起興奮收縮耦聯，此過程對于心臟正常功能的發揮具有重要作用［1，2］。除此之外，L型鈣離子通道還可參與可興奮細胞神經遞質的分泌、釋放和自我調控轉錄［3，4］。心肌L型鈣離子通道即Cav1.2鈣通道的正常表達是心臟收縮的必要前提，Cav1.2鈣通道的缺乏導致血管肌源性收縮無法正常進行，并且還可干擾激素對血壓的正常調節［5］。目前研究表明心肌Cav1.2鈣通道的表達與功能異常與多種疾病密切相關，例如已知的與Cav1.2鈣通道相關的疾病,包括Timothy綜合征、Brugada綜合征、房顫、心律失常、心力衰竭等［6，7］。

心肌Cav1.2鈣通道可直接或間接受磷酸化和氧化還原作用所調節［8，9］，也可被細胞內激素、蛋白激酶、磷酸化蛋白酶、鈣調蛋白（calmodulin，CaM）、鈣調蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ）等［8，10，11］多種細胞因子所調節，從而引起通道活性的變化，進而影響通道的功能改變。心肌Cav1.2鈣通道具有較長的C末端片段，此部位是通道功能調節的重要部位，在或戰或逃反應中發揮重要作用。而CT3（a.a.1942-2169）是位于Cav1.2鈣通道C末端遠端的片段遠端羧基末端（distal carboxy terminus，DCT）的一段片段，DCT在或戰或逃反應中作用關鍵，對Cav1.2通道的調節發揮著重要作用。有研究報道稱DCT能夠抑制通道活性［12～14］，然而，詳細的調節機制尚不完全清楚。因此，獲得DCT上的鈣通道片段CT3蛋白對于鈣通道相關調節機制的研究具有重要的意義。目前，實驗室提取鈣通道片段CT3蛋白是通過GST標簽再經大腸埃希菌誘導大量表達而形成重組蛋白GST-CT3。然而與其他GST標簽的蛋白相互作用時，往往需要用酶切掉標簽GST而得到純化的CT3蛋白。由于GST-CT3蛋白的特性，常規實驗條件下酶無法切掉GST-CT3蛋白的標簽GST。針對這一難題，本研究采用高濃度的還原劑二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）探尋酶切除GST-CT3蛋白的標簽GST得到純化的CT3蛋白的方法，為Cav1.2通道調節機制的相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pGEX-6P-3和BL21菌種，購自美國Amersham Pharmacia Biotech公司；DTT、異丙基硫代半乳糖苷、氨芐西林、溶菌酶，購自日本Wako公司。絲氨酸蛋白酶、GST融合蛋白純化凝膠（Glutathione-4B beads）、DNA酶（Turbo nuclease），購自英國GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pGEX-6P-3/CT3的誘導及表達：將重組質粒pGEX-6P-3/CT3化入BL21細菌中，在于含有0.1 mg/mL氨芐西林的LB培養液中培養，37℃水浴、100 r/min震蕩過夜。將菌液用LB培養液稀釋至OD 0.6～0.8范圍內［15］，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷，37℃水浴、100 r/min震蕩5 h，誘導表達重組蛋白GST-CT3。

1.2.2 DTT提取和純化無標簽的CT3蛋白：將菌液按照6 000 r/min離心15 min，棄掉上清收集沉淀。將沉淀重懸，每克沉淀加入4 mL B-PER［16，17］、0.2 mg/mL溶菌酶、1 μL DNA酶（Turbo nuclease）和蛋白酶抑制劑，室溫震蕩30 min以促進細菌破膜、DNA溶解及GST-CT3蛋白的釋放。16 000 r/min離心20 min，取上清置于2個15 mL EP管中，分別與PBS buffer洗過的300 μL GS-4B beeds在4℃孵育搖晃過夜。800 r/min離心棄上清，beeds分別用5 mL PBS buffer和Tris buffer各洗2次，留取少量的beeds（為GST-CT3蛋白）記為P1，取其中一管加990 μL Tris buffer和10 μL PreScission蛋白酶，標記為Control；另一管加990 μL Tris buffer、10 μL PreScission蛋白酶和終濃度為10 mmol/L DTT標記為DTT，分別4℃孵育搖晃6 h。

1.2.3 DTT提取和純化后CT3蛋白的鑒定：將上述PreScission蛋白酶酶切后的2管蛋白分別離心留取上清10 μL記為S，分別留取少許沉淀beeds記為P2，各留取的樣品經1×loading緩沖液室溫處理20 min后，80℃加熱5 min，進行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據Marker位置檢測CT3蛋白。

2 結果

2.1 單純酶切方法無法提取和純化CT3蛋白

將單純PreScission蛋白酶酶切之前的GST-CT3蛋白，即P1、PreScission蛋白酶酶切之后的上清，即S、和沉淀，即P2，分別進行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，經考馬斯亮藍染色。如圖1所示，經單純Pre-Scission蛋白酶酶切之后，上清無任何蛋白的存在，而沉淀蛋白仍以GST-CT3蛋白形式存在。該結果證實了GST-CT3蛋白的標簽GST無法被PreScission蛋白酶酶切掉。

圖1 單純酶切法無法提取出CT3蛋白Fig.1 CT3 protein could not be obtained by using enzyme alone

2.2 DTT能夠提取純化出高濃度的CT3蛋白

將PreScission蛋白酶酶切之前的GST-CT3蛋白，即P1、在10 mmol/L DTT存在的情況下經PreScission蛋白酶酶切之后的上清，即S、和沉淀，即P2，分別進行12.5%SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍染色。如圖2所示，在10 mmol/L DTT存在的情況下經PreScission蛋白酶酶切之后，上清存在較多的CT3蛋白，而沉淀則為較多的GST蛋白和極少量的CT3蛋白，幾乎不存在GST-CT3蛋白。以上結果說明10 mmol/L DTT能夠有助于PreScission蛋白酶酶切GST -CT3蛋白的標簽GST，且酶切效率較高。

圖2 高濃度DTT能夠提取出高純度、高濃度CT3Fig.2 The CT3 protein could be obtained with high concentration of DTT

3 討論

越來越多的研究表明，Cav1.2鈣通道的DCT在通道功能調節過程中起到重要作用。有研究報道，A激酶錨定蛋白能夠通過一修飾的亮氨酸拉鏈結合于DCT，而參與β-腎上腺素對心肌細胞Cav1.2通道的調節，從而抑制通道的活性［13］。亦有研究報道稱，DCT能夠與Cav1.2通道C末端近端上的CB/IQ區域直接結合從而掩蓋了CaM蛋白與通道的結合位點，抑制了CaM蛋白與通道的結合因此抑制通道的活性［14］。可見，DCT在Cav1.2通道的功能調節中具有關鍵的作用，因此獲得DCT上的鈣通道片段CT3蛋白對于鈣通道的研究具有重要的意義。大腸埃希菌由于其操作簡單、成本低、生長快、產量高等特性常常用于重組蛋白的表達。GST標簽的CT3蛋白（GST-CT3）在經大腸埃希菌誘導及表達是實驗室提取純化重組蛋白的常用方法，但由于重組蛋白結構的差異，GST-CT3蛋白的標簽GST很難被PreScission蛋白酶所切掉，然而由于實驗的需求，常常需要不含標簽GST的單純CT3蛋白。目前針對這一難題，有研究者提出在PreScission蛋白酶酶切過程中加入高鹽、甘油等方法有助于酶切，但是效果均不理想，因此需要單純CT3蛋白的相關實驗無法開展。DTT被報道有助于重組人神經營養因子3、重組牛乳鐵蛋白等多種重組蛋白的提取［18，19］，而是否能夠有助于GST-CT3重組蛋白的提取目前尚無研究報道，因此本研究在重組蛋白GST-CT3應用高濃度DTT，探討其是否能夠有助于提取純化單純CT3蛋白。

本研究在PreScission蛋白酶酶切過程中加入高濃度DTT（10 mmol/L）。實驗結果顯示，與不加DTT相比，10 mmol/L DTT能夠有助于PreScission蛋白酶酶切掉GST-CT3蛋白的標簽GST，酶切效率很高，幾乎不存在未經酶切的GST-CT3蛋白，并且提取純化出的單純CT3蛋白的純度和產量均相對較高。GSTCT3重組蛋白結構的差異使其不易被PreScission蛋白酶切除標簽GST，其原因可能由于在GST-CT3重組蛋白提取純化的過程中，長期暴露于空氣之中，使其被空氣中的氧氣氧化而引起蛋白結構的改變，掩蓋或改變了PreScission蛋白酶在蛋白上的作用部位，因此PreScission蛋白酶無法發揮其正常功能。而DTT是一種可滲透過細胞膜的小分子還原劑，常常用于蛋白的提取，最近有研究報道稱DTT作為還原試劑可以調控不同組織中Ca2+、Na+、KATP通道。而本實驗中加入了高濃度的DTT，可以還原被空氣氧化的GST-CT3重組蛋白，使其結構趨于正常，暴露出PreScission蛋白酶的作用部位。因此可以獲得高濃度的單純CT3蛋白。

綜上所述，高濃度DTT方法能夠提取純化高產量、高純度的Cav1.2鈣通道片段CT3蛋白，可以廣泛應用于實驗研究中，為Cav1.2通道的研究奠定了基礎。然而本實驗仍存在不足，由于DTT（10 mmol/L）濃度較高，提取出的CT3蛋白含有較高含量的DTT，可能會對后續研究產生一定的影響，在有條件的情況下最好使用小分子滲透膜將小分子的DTT濾除，然后得到更為純凈的不含DTT的單純CT3蛋白。

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（編輯 陳 姜）

Purification ofCT3 FragmentofCav1.2 with Dithiothreitol

SUN Yu1，FENG Rui1，YANG Lei2，MAO Nan1，HU Hui-yuan1，SUN Xue-fei1，HAO Li-ying1
（1.DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110122，China；2.IndustrialGoods Center，Entry-exitInspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300300，China）

Objective To explore whetherdithiothreitol（DTT）is helpfulfor PreScission Protease to cutoffthe GST from GST-CT3 protein.MethodsThe pGEX-6P-3/CT3 recombinant plasmid was transfected into Escherichia coli BL21，and the GST-CT3 fusion protein was purified by BPER method.PreScission Protease was applied with 10 mmol/L DTT to cut off the GST，then the SDS-PAGE was performed for identification of the CT3 protein.ResultsWithout DTT，it was very difficult for PreScission Protease to cut off the GST from GST-CT3 protein.However，in the presence of10 mmol/L DTT，PreScission Protease could cutoffthe GSTeasily as identified by SDS-PAGE.Conclusion10 mmol/L DTT can help Pre-Scission Protease to cutGSTfrom GST-CT3 protein，so as to achieve high concentration ofCT3.

fusion protein；cardiac myocytes；calcium channel

R96

A

0258-4646（2015）07-0588-04

國家自然科學基金（31471091，31400981）

孫宇（1989-），女，碩士研究生.

郝麗英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2015-01-13

網絡出版時間：