乙醇對小鼠認知能力的影響及其與海馬M1受體的關系

鄒丹，吳敏范，金戈，鄭燕，陳鳳梅

（沈陽醫(yī)學院1.病理生理教研室；2.生理教研室；3.藥理教研室；4.2012級臨床醫(yī)學，沈陽 110034）

·論著·

乙醇對小鼠認知能力的影響及其與海馬M1受體的關系

鄒丹1，吳敏范2，金戈3，鄭燕4，陳鳳梅4

（沈陽醫(yī)學院1.病理生理教研室；2.生理教研室；3.藥理教研室；4.2012級臨床醫(yī)學，沈陽 110034）

目的研究乙醇對小鼠認知能力的影響及其與小鼠海馬結構M1毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M1受體）含量變化的關系，進一步揭示乙醇引起腦損傷的機制。方法將60只雌性小鼠隨機分為對照組、8%、16%、32%乙醇給藥組，以0.2 mL/10 g給藥8周后，Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力，ELISA法檢測各組小鼠海馬結構中M1受體含量的差異。結果與各自第1天比較，各實驗組小鼠第5天逃避潛伏期均值均明顯縮短。各乙醇組小鼠第5天逃避潛伏期均值與對照組第5天均值比較，無統(tǒng)計學差異。16%、32%乙醇組小鼠在靶象限活動時間明顯短于對照組。各乙醇組小鼠海馬結構內M1受體含量與對照組比較明顯下降，且與乙醇攝入量呈劑量依賴關系。結論海馬結構M1受體含量降低是乙醇引起小鼠記憶能力下降的原因之一。

乙醇中毒；海馬結構；M1受體；認知

乙醇是親脂性小分子化合物，能迅速通過血腦屏障作用于腦組織，與神經(jīng)細胞膜有較高的親和力，并通過作用于膜上的某些酶類和受體而影響細胞的功能，進而引起學習、記憶、認知、判斷等一系列神經(jīng)行為功能的改變。研究表明，乙醇中毒已成為誘導癡呆發(fā)病的重要因素［1］。海馬結構作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，與學習、記憶及感覺信息加工密切相關。急性乙醇攝入可以通過影響海馬的θ節(jié)律及海馬錐體細胞神經(jīng)元活性等對海馬的生理功能造成影響［2］。急性乙醇中毒主要損害空間記憶能力，且海馬結構CA1區(qū)Fos表達明顯減少［3］，進一步提示乙醇對神經(jīng)系統(tǒng)的作用與其對海馬結構的特異性影響有密切關系。膽堿能神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)元，M1毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M1 muscarinic acetylcholine receptors，M1受體）主要分布于大腦皮質、海馬結構、紋狀體等神經(jīng)組織，定位于突觸后膜，接受突觸前末梢釋放的乙酰膽堿的刺激，海馬結構內的M1受體直接參與空間學習記憶過程［4］。乙醇引起小鼠學習記憶能力下降可能是通過影響海馬中M1受體的表達水平來介導的。

本研究擬采用Morris水迷宮對小鼠慢性乙醇攝入引起的認知功能損傷進行評價，旨在找到乙醇對小鼠認知影響的量效規(guī)律，并通過ELISA法測定小鼠海馬結構M1受體的含量，探討乙醇對海馬損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雌性昆明種小鼠60只，6周齡，體質量（23±3）g，購自遼寧長生生物技術有限公司，自由攝食、飲水。

1.1.2 試劑：乙醇（分析純，≥99.7%，北京化工廠），根據(jù)濃度要求每天灌胃給藥前臨時配制；小鼠M1受體ELISA試劑盒（美國Bluegene公司，批號：E03A0107）。

1.1.3 儀器：（1）Morris水迷宮（成都泰盟科技有限公司）：水池直徑100 cm，高50 cm。平臺直徑8 cm，高24 cm。水池上方通過攝像頭與計算機相連，記錄小鼠游泳軌跡，通過分析軟件獲得小鼠全程游泳軌跡、找到平臺所需的時間（潛伏期）、總的游泳路程，以及每一象限（水迷宮分為4個象限）的游泳時間等實驗數(shù)據(jù)。水迷宮測試時的環(huán)境應保證黑暗和安靜，使小鼠的行為不受外界干擾。小鼠開始訓練后，周圍物體位置需固定。（2）其他：Biofuge 28RS低溫高速離心機（德國Heraeus Sepatech公司）；ELx800酶標儀（美國BioTek公司）；Heros-Mole TL2020高通量組織研磨儀（北京鼎號源科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物處理：經(jīng)1周適應期飼養(yǎng)，將小鼠隨機分成4組（對照組及低、中、高劑量乙醇組），每組15只。低、中、高劑量乙醇組灌胃給藥劑量分別為乙醇體積分數(shù)8%、16%、32%（即3個劑量乙醇組的給藥量分別為：1.28、2.56、5.12 g/kg），正常對照組為等量蒸餾水。每天于早8點對小鼠進行灌胃給藥，連續(xù)8周。

1.2.2 Morris水迷宮記憶功能測定：（1）定位航行實驗（反映空間記憶的獲得能力）：于實驗第57天，停止給藥。對40只小鼠進行水迷宮訓練5 d，每天訓練2次（上午10點，下午14點），每次60 s。將小鼠面朝池壁放入水中，同時啟動記錄裝置，通過該系統(tǒng)的圖像分析軟件可獲得小鼠在水中的逃避潛伏期。小鼠找到并爬上平臺后，讓其停留5 s，若小鼠入水后60 s內未能找到并爬上平臺，則將其引導至平臺上停留10 s，此時逃避潛伏期記錄為60 s。每次訓練完成后，迅速將小鼠擦干，防止低體溫。每天各小鼠逃避潛伏期用2次訓練的均值表示。（2）空間搜索實驗（檢測空間記憶的保持能力）：實驗第62天撤去平臺，每只小鼠從固定象限中點面朝池壁放入水中，記錄小鼠60 s池內活動情況，通過該系統(tǒng)的圖像分析軟件獲得60 s內小鼠經(jīng)過原平臺所在靶象限的時間。

1.2.3 實驗取材：完成空間搜索實驗后立即斷頭處死小鼠，冰上分離雙側海馬，置于-80℃保存，以備檢測各組海馬結構M1受體水平。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法測定海馬中M1受體含量：先用預冷的PBS（0.02 mol/L，pH7.0～7.2）清洗組織后稱質量，5 mg組織加入40 μL預冷PBS（0.02 mol/L，pH7.0～7.2）。用高通量組織研磨儀裂解細胞，5 000 r/min離心15 min后取上清。按照ELISA試劑盒說明書操作，分別將標準品及樣品各100 μL加入微孔中，空白對照加入100 μL PBS（pH7.0～7.2）。取10 μL平衡液加入100 μL樣品中。在各孔中加入50 μL的酶標記溶液（不含空白對照組）。37℃孵育反應1 h。充分清洗酶標板5次，酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A、B各50 μL。37℃避光反應15 min。終止反應后使用酶標儀（490 nm波長）依序測定各樣品中M1受體的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠一般狀態(tài)

對照組小鼠皮毛光滑，身體健壯，飲食、活動、體質量增長正常；各乙醇組小鼠皮毛暗淡不整，精神不振，對外界刺激反應遲鈍，身體消瘦，進食等活動減少，死亡7只。各組剩余小鼠中隨機保留10只，進行水迷宮測試。

2.2 Morris水迷宮結果

2.2.1 不同濃度乙醇對小鼠學習能力的影響：各組小鼠的平均逃避潛伏期如圖1所示：經(jīng)過5 d的Morris水迷宮定位航行實驗，各組小鼠第5天逃避潛伏期均值均較第1天明顯縮短，對照組和8%、16%、32%乙醇組第5天逃避潛伏期均值分別為（34.47± 9.46）s，（29.65±14.15）s，（35.71±12.57）s，（37.03± 11.81）s；第1天逃避潛伏期均值分別為（54.29± 11.75）s，（52.97±8.10）s，（53.73±9.35）s，（58.20± 3.18）s，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明隨著定位航行訓練次數(shù)的增加，各組小鼠都具有了一定的空間學習能力。

圖1 各組小鼠第1天和第5天定位航行測試平均逃避潛伏期比較Fig.1 The escape latency of place navigation test is compared between the first day and fifth day in each group

2.2.2 不同濃度乙醇對小鼠記憶能力的影響：小鼠完成5 d的Morris水迷宮定位航行實驗后，于第6天進行空間探索測試，圖2所示為各組小鼠在原平臺所在靶象限活動時間。與對照組［（21.20±5.11）s，n=10］比較，8%乙醇組［（22.61±4.88）s，n=10］在靶象限的活動時間稍有延長，但差異無統(tǒng)計學意義。16%乙醇組［（16.21±5.21）s，n=10］與32%乙醇組［（14.75±4.79）s，n=10］在靶象限的活動時間明顯短于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），表明16%與32%乙醇對小鼠的記憶能力有一定的損傷作用。

圖2 各組小鼠第6天空間探索測試靶象限活動時間比較Fig.2 The active time in the target quadrant in spatial probe test is compared among each group on the sixth day

2.3 不同濃度乙醇對小鼠海馬結構M1受體的影響

如圖3所示：小鼠經(jīng)過56 d的乙醇灌胃及后續(xù)6 d的水迷宮實驗測試后，8%、16%、32%乙醇組小鼠海馬結構M1受體濃度分別為（1 244.81±324.56）、（1 009.95±309.47）、（977.46±340.32）pg/mL，均低于對照組［（1 525.19±303.61）pg/mL］（P＜0.01）。表明8%、16%、32%的乙醇均可造成小鼠海馬結構M1受體含量下降。

圖3 各組小鼠海馬結構M1受體濃度比較Fig.3 Concentration of M1 receptor is compared among distinct groups

3 討論

學習是通過神經(jīng)系統(tǒng)不斷接受外界環(huán)境的刺激而獲得新知識、新行為的過程，即獲得信息的過程。學習與記憶密切相關，大腦儲存、提取和再現(xiàn)獲得的信息就是記憶。海馬是大腦邊緣結構的重要組成部分，不僅與學習記憶有關，還參與注意、感知覺信息處理、情緒和運動等多種生理、心理過程。研究表明，產(chǎn)前酒精暴露的青年人記憶力的欠缺與包括海馬在內的腦容量降低密切相關［5］。海馬組織與大腦皮質及皮質下中樞形成廣泛纖維連接，尤其是膽堿能神經(jīng)纖維，構成了三維結構，即信息回路。該回路可將短時記憶轉為長時記憶，并在空間、航行定位功能中起重要的作用［6］。海馬組織中富含乙酰膽堿等神經(jīng)遞質［7］，參與學習記憶過程。

本研究中，小鼠水迷宮定位航行測試結果顯示：對照組及各給藥組第5天逃避潛伏期均值都比各自組別的第1天潛伏期均值明顯縮短。盡管高、中劑量乙醇組第5天逃避潛伏期均值較對照組第5天有升高趨勢，但并無統(tǒng)計學差異。而低劑量乙醇組第5天逃避潛伏期均值較對照組第5天有降低趨勢，亦無統(tǒng)計學差異。提示經(jīng)8周高、中、低劑量乙醇灌胃給藥處理后，各組小鼠學習能力差異不明顯。最近的研究表明，小鼠慢性乙醇暴露后急性停用乙醇，雖削弱了情境學習能力，但提高了線索學習能力［8］。水迷宮空間探索測試的結果顯示：與對照組相比，8%乙醇組小鼠在靶象限的活動時間稍有延長，但無統(tǒng)計學差異。16%與32%乙醇組小鼠在靶象限的活動時間明顯短于對照組（P＜0.05，P＜0.01）。表明小鼠經(jīng)8周高、中劑量乙醇灌胃給藥處理，空間記憶功能有明顯的損傷。提示乙醇對空間學習能力和空間記憶能力的影響可能存在差異。

研究表明，M1受體有利于哺乳動物的探查行為，也是乙酰膽堿對錐體細胞興奮性發(fā)揮最直接作用的必要條件［9］。M1受體是參與興奮性海馬環(huán)路的膽堿能直接調節(jié)的主要M受體亞型［10］。大鼠海馬神經(jīng)元細胞表面M1受體激活可引發(fā)磷脂酰肌醇水解以及θ節(jié)律的網(wǎng)絡振蕩，瞬時提高長時程增強（long-term potentiation，LTP），而細胞內的M1受體激活可使細胞外的調節(jié)激酶磷酸化，逐漸提高LTP［11］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過8周乙醇灌胃處理后，高、中、低3個劑量組海馬結構M1受體的濃度較對照組均降低；乙醇高、中劑量組小鼠空間探索測試實驗中靶象限活動時間較對照組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義，提示高、中劑量乙醇對小鼠記憶功能的損傷可能與M1受體濃度降低有關。低劑量乙醇組小鼠記憶功能沒有明顯減退，而M1受體仍然降低，表明腦內除M1受體外，還有其他機制參與復雜的學習記憶過程，有待進一步研究。

［1］Bernardin F，Maheut-Bosser A，Paille F.Cognitive impairment of alcohol-dependent subjects［J］.Rev Prat，2014，64（4）：462-465.

［2］Silver JM，Tokunaga S，Berry RB，et al.Impairments in spatial learning and memory：ethanol，allopregnanolone，and hippocampus［J］. Brain Res Rev，2003，43（3）：275-284.

［3］Lu B，Ma Z，Cheng F，et al.Effects of electroacupuncture on ethanolinduced impairments of spatial learning and memory and Fos expression in the hippocampus in rats［J］.Neurosci Lett，2014，576：62-67.

［4］Haley GE，Kroenke C，Schwartz D，et al.Hippocampal M1 receptor function associated with spatial learning and memory in aged female rhesus macaques［J］.Age（Dordr），2011，33（3）：309-320.

［5］Coles CD，Goldstein FC，Lynch ME，et al.Memory and brain volume in adults prenatally exposed to alcohol［J］.Brain Cogn，2011，75（1）：67-77.

［6］Stella F，Cerasti E，Si B，et al.Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus［J］.Neurosci Biobehav Rev，2012，36（7）：1609-1625.

［7］Mora F，Segovia G，Del Arco A，et al.Stress，neurotransmitters corticosterone and body-brain integration［J］.Brain Res，2012，1476：71-85.

［8］Tipps ME，Raybuck JD，Buck KJ，et al.Acute ethanol withdrawal impairs contextual learning and enhances cued learning［J］.Alcohol Clin Exp Res，2015，39（2）：282-290.

［9］Gulledge AT，Bucci DJ，Zhang SS，et al.M1 receptors mediate cholinergic modulation of excitability in neocortical pyramidal neurons［J］.J Neurosci，2009，29（31）：9888-9902.

［10］Dasari S，Gulledge AT.M1 and M4 receptors modulate hippocampal pyramidal neurons［J］.J Neurophysiol，2011，105（2）：779-792.

［11］Anisuzzaman AS，Uwada J，Masuoka T，et al.Novel contribution of cell surface and intracellular M1-muscarinic acetylcholine receptors to synaptic plasticity in hippocampus［J］.J Neurochem，2013，126（3）：360-371.

（編輯 王又冬）

Correlation Study ofCognitive Disorder Induced by Ethanoland M1 Receptor in Hippocampusin Mice

ZOUDan1，WUMin-fan2，JINGe3，ZHENGYan4，CHENFeng-mei4
（1.DepartmentofPathophysiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；2.DepartmentofPhysiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；3.Department of Pharmacology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2012 Clinical Medicine，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo investigate the effectofethanolon levelofthe main hippocampalsubtype ofmuscarinic receptor（M1）in mice，and evaluate whetherthe contentchange on thisreceptorcould be linked with alterations in cognition，so as to furtherrevealthe mechanism ofbrain damage induced by ethanol.MethodsSixty female mice were randomly divided into four groups.The model mice were induced by intragastric administration of ethanol at dose of 8%，16%，and 32%respectively of 0.2 mL/10 g for 8 weeks according to the protocol，and control group were treated with intragastric administration of distilled water.The capability of learning and memory were examined by Morris water maze，and ELISA method was used to measure the M1 receptor content in hippocampus in each group of mice.ResultsCompared with first day，the mean escape latency period on the fifth day was significantly shortened in each group.There was no significant difference between ethanol and control group for the mean escape latency period on the fifth day.Compared with the control group，the active time in the target quadrant was significantly shortened in 16%and 32%ethanol group.M1 receptor content in hippocampus formation was significantly decreased in all the ethanol group mice.The ethanol concentration was negative correlated with the M1 receptor content.ConclusionChronic alcoholism can induce the memory impairment in mice，which might be associated with the low levelofM1 receptorsubtype in hippocampusofmice.

alcoholism；hippocampus formation；M1 receptor；cognition

R338.2

A

0258-4646（2015）07-0602-04

教育部留學歸國人員科研啟動基金（2013-693）

鄒丹（1971-），女，副教授，博士.

E-mail：zoudan1166@hotmail.com

2014-12-24

網(wǎng)絡出版時間：