地黃梓醇對原代培養SD乳大鼠成骨細胞成骨活性的影響研究

賈英民，李瑞玉，武密山，霍瑞樓，李 彬

(1. 北京軍區總醫院，北京 100700；2. 河北省平鄉縣中西醫結合醫院，河北 平鄉 054500；3. 邢臺醫學高等專科學校第二附屬醫院，河北 邢臺 054000；4. 河北中醫學院，河北 石家莊 050090；5. 河北醫科大學，河北 石家莊 050051)

地黃梓醇對原代培養SD乳大鼠成骨細胞成骨活性的影響研究

賈英民1，2，李瑞玉3，武密山4，霍瑞樓2，李 彬5

(1. 北京軍區總醫院，北京 100700；2. 河北省平鄉縣中西醫結合醫院，河北 平鄉 054500；3. 邢臺醫學高等?？茖W校第二附屬醫院，河北 邢臺 054000；4. 河北中醫學院，河北 石家莊 050090；5. 河北醫科大學，河北 石家莊 050051)

目的 觀察不同濃度地黃梓醇對體外培養新生SD大鼠成骨細胞增殖及成骨活性的影響，為地黃防治骨質疏松癥提供實驗依據。方法 體外培養原代新生24 h SD大鼠成骨細胞，細胞傳至第5代，分別加入1×10-3，1×10-5，1×10-7，1×10-9mol/L梓醇溶液及生理鹽水10 μL/孔， 繼續培養24，48，72 h后，分別檢測成骨細胞增殖情況、骨鈣素(BGP)及堿性磷酸酶(ALP)活性。結果 培養24 h時，1×10-3mol/L梓醇溶液能顯著促進成骨細胞增殖(P<0.05)；培養48 h時，1×10-3mol/L梓醇溶液促增殖作用最強(P<0.05)。培養48 h時，1×10-7mol/L組和1×10-3mol/L組ALP活性顯著高于對照組(P均<0.05)；培養72 h時，1×10-3mol/L組ALP活性顯著增加(P<0.05)。培養48，72 h后，各濃度梓醇溶液組BGP活性均高于對照組(P均<0.05)，且1×10-3mol/L組明顯高于其他濃度組(P均<0.05)。結論 梓醇在1×10-5mol/L和1×10-3mol/L范圍對體外培養SD大鼠成骨細胞的增殖、分化及成骨作用相對顯著，尤其在1×10-3mol/L濃度下作用最顯著，且具有時效及量效關系。

骨質疏松；地黃；梓醇；成骨細胞；增殖；分化；堿性磷酸酶；骨鈣素

梓醇(Catalpol)是從玄參科植物地黃中分離的小分子環烯醚萜類化合物，極性結構，易溶于水，分子式C15H22O10。梓醇是地黃中有效活性成分之一，且含量最多，為具有“滋陰”功效的主要活性成分。研究表明梓醇具有利尿、緩瀉、降血糖、保肝及抗衰老等多種藥理活性[1-2],可用于神經系統疾病、心血管疾病、腫瘤疾病、糖尿病等多種疾病的防治。目前研究發現以地黃為主組成的補腎方藥具有明顯的抗骨質疏松作用[3-4]，但相關的基礎研究尚缺乏系統性。本實驗采用細胞培養技術，以成骨細胞增殖、骨鈣素(BGP)活性及堿性磷酸酶(ALP)活性為指標，觀察了地黃梓醇對體外培養新生SD大鼠成骨細胞增殖、分化的影響，從而評價地黃梓醇在骨代謝過程中對成骨細胞的生物學作用。

1 實驗資料

1.1實驗動物 出生24 h內的SD系乳大鼠， 購于河北醫科大學實驗動物中心，合格號:903124。

1.2 試劑和藥品 梓醇(中國藥品生物制品檢定所，批號：110808-200407)，胰蛋白酶(美國Sigma公司，批號：27250018)，DMEM培養基(Invitrogen Corporation公司，批號:1280334),胎牛血清(FBS，中美合資蘭州民海生物工程有限公司,批號:20060402),Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司,批號:17101-015),四甲基偶氮唑藍(MTT,美國Sigma公司),堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),骨鈣素放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業生物科技有限公司),二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司)。

1.3 儀器 COIC XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司),318MC型雙波光酶標儀(上海三科儀器有限公司)，酶聯免疫檢測儀(MRX-Ⅱ型，美國Dynex公司)，超凈化工作臺(北京冠鵬凈化設備有限公司)，CO2培養箱(Serical No:20201356,日本三陽生物電子有限公司)。

1.4 實驗分組 梓醇用DMEM培養液稀釋成1×10-3，1×10-5，1×10-7，1×10-9mol/L 4個濃度組，另設生理鹽水對照組，每個藥物濃度均設6個平行孔。

1.5 原代成骨細胞的培養 取出生24 h內SD乳大鼠，70%乙醇浸泡10～15 min，無菌條件下取出乳鼠的顱蓋骨，置于D-hanks液內，清洗數次，清除骨膜、血管等結締組織；將上液清洗過的骨片移入0.25%胰蛋白酶消化液中，37 ℃下預消化15 min，以去除纖維組織，然后將0.25%胰蛋白酶消化液棄掉，移入5 mL含有0.1%Ⅱ型膠原酶的消化液，37 ℃下消化40 min，用眼科剪將骨片剪成大小1～2 mm3的骨粒；棄去0.1%Ⅱ型膠原酶溶液，加入D-hanks液，清洗2～3次。將骨粒分散于100 mL培養瓶中，加入20% FBS的DMEM培養液，將培養瓶輕放入37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養。培養基3 d后換液1次，5 d后棄骨粒，細胞開始傳代培養。

1.6 成骨細胞增殖實驗 細胞傳至第5代，將細胞用胰蛋白酶消化，細胞計數后,用含10%小牛血清的DMEM培養基稀釋成4×107L-1的細胞懸液。以每孔0.2 mL加入96孔培養板，37 ℃、5%CO2培養箱中培養，鏡下觀察細胞70%融合時，將含血清培養基吸棄，平衡鹽溶液沖洗2次，更換新鮮培養液，同時分別加入1×10-3，1×10-5，1×10-7，1×10-9mol/L梓醇溶液及生理鹽水10 μL/孔，繼續培養24 h、48 h、72 h后，加入MTT 20 μL，于37 ℃、5%CO2的培養箱中進行培養4 h，加入DMSO 150 μL，用酶標儀于570 nm處測定OD值。

1.7 ALP的測定 試驗方法及藥物和濃度同1.6，繼續培養48 h、72 h后，吸棄培養液，加入0.25 mL 0.1%Triton溶液，吹打細胞，10 min后收集每孔溶液，用于ALP的測定。ALP測定采用對硝基苯磷酸二鈉基質動力學法(PNPP)。

1.8 BGP的測定 試驗方法及藥物和濃度同1.6，以每孔0.5 mL接種在24孔培養板中。試驗方法及藥物和濃度同上，培養24 h、48 h及72 h后，分別將2塊24孔板取出，吸取培養基，采用放免法按試劑盒說明進行BGP測定。

2 結 果

2.1不同培養時間各組成骨細胞增殖情況 培養24h時，1×10-3mol/L梓醇溶液能顯著促進成骨細胞增殖(P<0.05);培養48h時，1×10-3mol/L梓醇溶液促增殖作用最強，有效濃度為1×10-5～1×10-3mol/L(P<0.05)；培養72h時，不同濃度的梓醇溶液促進細胞增殖作用均減弱，各濃度組比較差異均無統計學意義(P均>0.05 )。見圖1。

圖1 不同培養時間各組成骨細胞增殖情況

2.2 不同培養時間各組ALP活性比較 培養48h時，1×10-7mol/L組和1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于對照組(P均<0.05)，且1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于1×10-7mol/L組(P<0.05)；培養72h時，1×10-3mol/L組ALP活性顯著高于其他組(P均<0.05)。見圖2。

2.3 不同培養時間各組BGP活性比較 培養24h時，各組BGP活性比較差異均無統計學意義；培養48h時，1×10-5mol/L組和1×10-3mol/L組BGP活性顯著高于其他組(P均<0.05)；培養72h時，各濃度組BGP活性均高于對照組，1×10-3mol/L組明顯高于其他組(P均<0.05)。見圖3。

3 討 論

圖2 不同培養時間各組ALP活性比較

圖3 不同培養時間各組BGP活性比較

在世界范圍內，骨質疏松癥已是一個越來越引起人們重視的健康問題，給患者生活帶來極大的痛苦和不便，已成為老年人生活質量下降甚至死亡的主要原因。骨質疏松癥是指單位體積骨量減少伴有骨強度的降低，主要與骨吸收和骨形成的動態平衡失調有關，該過程由成骨細胞和破骨細胞來完成。成骨細胞是骨代謝過程中的主要功能細胞，在骨基質的合成、分泌和礦化的骨代謝過程中有極其重要的作用[5-6]。成骨細胞數量不足或功能減退都會影響骨的修復過程，并可能引發骨質疏松癥，提高成骨細胞的增殖和分化水平是防治骨質疏松癥的關鍵。

地黃為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊根，始載于《神農本草經》，列為上品，味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經，具有滋陰補腎、養陰生津的功效。梓醇屬環烯醚萜苷類化合物，是從地黃中分離的單一化學成分， 2010版《中國藥典》明確規定梓醇作為地黃質量控制的指標[1]。本研究結果顯示各濃度梓醇溶液對成骨細胞增殖均具有促進作用，培養24h時，10-3mol/L梓醇溶液能顯著促進成骨細胞增殖；培養48h時，10-3mol/L梓醇溶液促增殖作用最強，隨著時間的延長，不同濃度的梓醇溶液促進細胞增殖作用均減弱，提示梓醇溶液對細胞增殖的促進作用具有時效性。

ALP是成骨細胞分化的特異性標志，由成骨細胞分泌，它既可作為成骨細胞的功能標記物，又可反映其分化成熟程度[7]。本實驗提示，培養48h時，1×10-7mol/L組和1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于對照組(P均<0.05)，且1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于1×10-7mol/L組(P<0.05)；培養72h時，1×10-3mol/L組ALP活性顯著高于其他

組(P均<0.05)。提示高濃度梓醇溶液能顯著促進成骨細胞分化，具有量效關系。

BGP又稱骨γ羧基谷氨酸蛋白，是由成骨細胞和成牙骨質細胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白，是構成骨基質的成分之一，其功能是保證骨的正常礦化速率。BGP與ALP高度相關，BGP被認為是成骨細胞分化成熟最具特征性的標志物，反映了成骨細胞成骨功能[8-9]。本實驗結果顯示，培養24h，不同濃度梓醇溶液組BGP活性未見明顯變化，可能與培養時間短有關；培養48h時，1×10-5mol/L和1×10-3mol/L濃度已出現促BGP的活性作用；培養72h后，與對照組相比，不同濃度梓醇溶液均對成骨細胞BGP活性有明顯促進作用，尤以 1×10-3mol/L濃度明顯。表明1×10-5mol/L和1×10-3mol/L濃度梓醇溶液對體外培養SD大鼠成骨細胞的增殖、分化及成骨作用相對顯著，尤其在1×10-3mol/L的高濃度下作用最顯著，且具有時效及量效關系。

綜上所述，地黃單體成分梓醇可促進體外培養大鼠成骨細胞增殖及成骨活性，為補腎中藥防治骨質疏松癥的進一步研究提供了參考和探索。

[1] 劉彥飛,趙宇,溫學森,等. 梓醇的藥效學及化學轉化研究現狀[J]. 中國中藥雜志,2007,12(32):1128-1230

[2] 董炤,陳長勛. 梓醇藥理作用的研究進展[J]. 中成藥,2013,35(5):1047-1051

[3] 賈英民,武密山,李恩. 補腎方劑對成骨細胞體外培養干預的研究進展[J]. 現代中西醫結合雜志,2011,20(31):4035-4037

[4] 武密山,李恩,趙素芝,等. 抗骨松顆粒對去卵巢大鼠骨質含量和生物力學的影響[J]. 中國老年學雜志,2008,28(23):2289-2292

[5]IwamotoJ,SatoY,TakedeT,etal.Bonequalityandvitamink2intype2diabetes:Reviewofpreclinicalandclinicalstudies[J].NutrRev,2011,69(3):162-167

[6] 陳述祥,康樂. 中藥促成骨細胞增殖和分化的機制與作用[J]. 中國組織工程研究,2012,16(7):1299-1302

[7]VerborgtO,GibsonGJ,SchafflerMB.Lossofosteocyteintegrityinassociationwithmicrodamageandboneremodelingafterfatigueinvivo[J].JournalofBoneandMineralResearch,2000,15(1):60-67

[8]GameroP.Biomarkersforosteoporosismanagement:utilityindiagnosis,fractureriskpredictionandtherapymonitoring[J].MolDiagnTher,2008,12(3):157-170

[9]AonumaH,MiyakoshiN,HongoM,etal.Lowserumlevelsofundercarboxylatedosteocalininboneresorption[J].TohpkuJExpMed,2009,218(3):201-205

Study on the effect of Catalpol on osteoblastic activity of primary cultured osteoblast in SD neonatal rats

JIA Yingmin1,2, LI Ruiyu3, WU Mishan4, HUO Ruilou2, LI Bin5

(1.Beijing Military General Hospital, Beijing 100700, China;2.Integrated Traditional and Western Medicine Hospital of Pingxiang, Pingxiang 054500, Hebei, China;3.The Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei, China;4.Hebei College of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050090, Hebei, China;5.Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to observe the effect of Catalpol at different concentrations on proliferation and osteoblast activity of primary cultured osteoblast in neonatal SD rats, thus to provide experimental evidence for the prevention and treatment of osteoporosis. Methods Primary rat neonatal 24 h SD osteoblasts were cultured in In vitro, when the cells spread to the 5th generation, they were added with different concentrations of 1×10-3, 1×10-5, 1×10-7, 1×10-9mol/L catalpol saline solution 10 μL/hole, then the culture continued, in 24 h, 48 h, 72 h after culture the proliferation, ALP activity and activity levels of BGP of osteoblasts were detected. Results When cultured for 24 h time, 1×10-3mol/L Catalpol could promote the proliferation of osteoblasts significantly (P<0.05); For 48 h, the proliferation effect of 1×10-3mol/L Catalpol was the strongest (P<0.05). Compared with the control group when cultured for 48 h, the activity of ALP in 1×10-7mol/L and 1×10-3mol/L was significantly higher(P<0.05), for 72 h in 1×10-3mol/L group, the ALP activity was increased significantly(P<0.05). When cultured for 48 h and 72 h, compared with the control group, the activity of BGP in every Catalpol group was all higher (allP<0.05), especially in 1×10-3mol/L group, the activity was the highest than the other groups (P<0.05). Conclusion Catalpol at the concentration range from 1×10-5mol/L to 1×10-3mol/L had significant effect on the proliferation, differentiation and osteoblast activity of primary cultured osteoblast in vitro in neonatal SD rats, especially the effect at concentration of 1×10-3mol/L was most significant, and there was relationship of time-effect and dose-effect.

osteoporosis; Radix rehmanniae; Catalpol; osteoblasts; proliferation; differentiation; alkaline phosphatase; bone glaprotein

賈英民，男，醫學碩士，主治醫師，主要從事慢性腎臟病與骨代謝的中西醫結合臨床、教學及科研工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.005

R-33

A

1008-8849(2015)23-2524-03

2015-01-06