轉錄因子E2F1在腦膜瘤中的表達和臨床意義

王獻明，趙軍蒼，蘇鈺清，田云霄，姜樹勤

(1.河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市傳染病醫院，河北 邯鄲 056002)

轉錄因子E2F1在腦膜瘤中的表達和臨床意義

王獻明1，趙軍蒼1，蘇鈺清1，田云霄1，姜樹勤2

(1.河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市傳染病醫院，河北 邯鄲 056002)

目的 研究轉錄因子E2F1在腦膜瘤中的表達情況及其臨床意義。方法 選擇57例經病理確診為腦膜瘤患者及同期行腦外科手術治療的38例非腦膜瘤患者，應用實時定量PCR方法和Western blot方法定量檢測轉錄因子E2F1在腦膜瘤組織和正常腦膜中的表達情況，并采用免疫組織化學染色方法檢測腦膜瘤組織中E2F1蛋白的表達定位。根據E2F1的表達情況分析其與腦膜瘤分型和預后的關系。結果 實時定量PCR結果顯示腦膜瘤組織中E2F1 mRNA表達水平顯著高于正常腦膜組織，而且惡性腦膜瘤組織中E2F1 mRNA表達高于良性腦膜組織(P<0.01),Western blot結果也證實腦膜瘤組織中E2F1蛋白表達水平顯著高于正常腦膜組織(P<0.01)。免疫組織化學染色結果顯示腦膜瘤組織中E2F1蛋白主要定位在細胞核中。腦膜瘤組織中E2F1強陽性表達率為65%，正常腦膜組織中E2F1強陽性表達率為10%，二者比較差異具有統計學意義(P<0.01)。不典型和惡性腦膜瘤組織中E2F1強陽性表達率顯著高于良性腦膜瘤。3年內腦膜瘤復發組E2F1表達陽性率顯著高于無復發組(P<0.01)。結論 E2F1在腦膜瘤組織中表達增強，并且與腦膜瘤的惡性程度和復發率呈正相關。

腦膜瘤;E2F1轉錄因子;復發;細胞周期

腦膜瘤是顱內常見的腫瘤之一，大多數生長緩慢，病程較長，有部分患者腦膜瘤呈侵襲性生長[1]。腦膜瘤以手術切除治療為主，大部分患者手術治療后可獲得治愈，但有一部分患者容易復發[2-3]。目前關于腦膜瘤的發生、轉移及復發機制尚不清楚，隨著分子生物學和基因研究的深入，已經鑒定了多種與腦膜瘤發生發展有關的基因，包括p53、MCM6、EGFR等。研究認為多種基因及多種因素參與了腦膜瘤的發生發展過程，而尋找特異性強和靈敏度高的潛在分子標志物有利于腫瘤的早期診斷和預后分析。E2F1屬于E2F轉錄因子家族中的一員，主要功能是參與細胞周期相關基因表達的轉錄調節，對細胞周期的進程進行調控[4-6]。研究發現E2F1可能參與了多種腫瘤的發生發展過程，包括食管癌、胃癌、前列腺癌等，并且與腫瘤的侵襲、轉移和預后有密切關系[7]。本研究通過實時定量PCR、Western-blot及免疫組織化學染色等方法定量和定性檢測了E2F1在腦膜瘤組織和正常腦膜組織中的表達情況，分析了E2F1在腦膜瘤中的表達及與組織病理分型和患者預后之間的關系，旨在為腦膜瘤的診斷和治療提供參考依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2004年1月—2008年12月在邯鄲市中心醫院經病理檢查診斷為腦膜瘤的患者57例，男39例，女18例;年齡18～68(34.6±12.8)歲;良性腦膜瘤31例，不典型和惡性腦膜瘤26例;患者均接受手術治療，術前未接受放化療、排除心血管疾病和其他腫瘤相關疾病。另選擇同期行其他腦外科手術的非腦膜瘤患者38例,男27例，女11例;年齡18～68(34.6±12.8)歲。

1.2 標本采集 手術切除腦膜瘤組織或正常腦膜組織，部分標本經液氮速凍后保存于-80 ℃中，用于RNA提取和蛋白提取實驗;部分標本經10%福爾馬林固定液固定24h后進行石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測。

1.3 實時定量PCR檢測 腦膜瘤組織及正常腦膜組織采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)進行總RNA提取，用TaKaRa的PrimeScript RT Master Mix試劑盒將提取的總RAN反轉錄成為cDNA。采用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計。E2F1上游引物為5’- CCCCAACTCCCTCTACCCT- 3’，下游引物為5’- GTCCCCCACTCACCTCTCC- 3’；GAPDH上游引物為5’- GTTGTCTCCTGCGACTTCA- 3’和5’-GGTGGTC CAGGGTTTCTTA-3’。然后根據TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行Real-time PCR反應。具體PCR擴增條件為：95 ℃預變性10 s，40個循環反應：95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34s，在60 ℃時采集熒光信號。PCR反應完成后制作融解曲線，并采用??CT法來分析各基因的相對表達差異量，由機器自帶軟件輸出相應的CT值，然后按照??CT法計算：??CT=(CT靶基因-CT內參)處理組-(CT靶基因-CT內參)對照組與對照組相比，靶基因在處理組中相對表達的差異倍數計算公式為：N處理組/對照組=2(-??CT)。

1.4 Western-blot分析 收集腦膜瘤和正常腦膜組織標本，提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經10%的SDS-PAGE電泳，采用半干電轉膜技術將蛋白質轉移至硝酸纖維薄膜。室溫封閉后，加入一抗為1∶1 000稀釋的anti-rabbit E2F1抗體(Santa Cruz)或anti-rabbit GAPDH(Santa Cruz)抗體稀釋液，4℃孵育16 h后，TBST洗膜，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(Santa Cruz)，室溫下搖床上輕搖1 h后，洗膜。將膜取出，與發光試劑反應，X射線片曝光，避光顯影，定影后進行分析，實驗重復3次。

1.5 免疫組織化學染色 腦膜瘤組織及正常腦膜組織經10%福爾馬林-石蠟包埋后，行組織切片，常規脫蠟至水，切片在枸櫞酸鈉修復液中微波加熱修復10 min，冷卻至室溫后用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min，將切片置于3%過氧化氫15 min消除內源性過氧化物酶，經PBS漂洗后，加入10%馬血清37 ℃封閉1 h。用10%馬血清配制1∶200的一抗稀釋液，4℃孵育過夜。用PBS漂洗3次后，用1% BSA配制的二抗稀釋液室溫孵育45 min，PBS漂洗3次，加入1% BSA配制的堿性磷酸酶標記的鏈親和素，室溫孵育30 min用PBS漂洗后，采用DAB顯色試劑盒進行顯色，待出現棕色信號后，終止顯色，蘇木精復染后經常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下拍照并進行分析。免疫組織化學染色以細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒為陽性表達。圖像分析采用OLYMPUS-BX41光學顯微鏡，每張切片在光學顯微鏡下隨機選擇5個視野進行圖像采集。

2 結 果

2.1腦膜瘤組織和正常腦膜組織中E2F1的表達 實時定量PCR結果顯示，E2F1 mRNA在腦膜瘤組織中的表達顯著高于正常腦膜組織(P<0.01)，見圖1。非典型和惡性腦膜瘤組織中E2F1 mRNA的表達水平顯著高于良性腦膜瘤組織(P<0.001)，見圖2。Western blot結果進一步驗證了E2F1蛋白在腦膜瘤組織的表達高于正常腦膜組織，見圖3。

圖1 實時定量PCR檢測正常腦膜組織和腦膜瘤組織中E2F1 mRNA的表達

圖2 實時定量PCR檢測良性腦膜瘤、非典型和惡性腦膜瘤組織中E2F1 mRNA的表達

2.2 腦膜瘤組織和正常腦膜組織中E2F1蛋白的定位 免疫組織化學染色結果顯示，在腦膜瘤組織中，E2F1主要表達在腫瘤細胞的細胞核中，見圖4；而在正常腦膜組織中，細胞核中E2F1表達較弱，僅可見少量細胞中有E2F1信號，染色較淺，見圖5。57例腦膜瘤組織中，E2F1表達陽性37例(65%);38例正常腦膜組織中，E2F1表達陽性4例(10%)，腦膜瘤組織中細胞核E2F1表達陽性率顯著高于正常腦膜組織(P<0.01)。

圖3 Western blot檢測正常腦膜組織和腦膜瘤組織中E2F1蛋白的表達

圖4 腦膜瘤組織中E2F1蛋白的表達(40×)

圖5 正常腦膜組織中E2F1蛋白的表達(40×)

2.3 E2F1的表達與腦膜瘤分型和預后的關系 31例良性腦膜瘤組織中細胞核E2F1表達陽性18例(58%)，26例不典型和惡性腦膜瘤組織中細胞核E2F1表達陽性19例(73%)，不典型和惡性腦膜瘤組織細胞核E2F1表達陽性率顯著高于良性腦膜瘤組織(P<0.01)。分析腦膜瘤組織細胞核中E2F1表達與患者臨床特征及預后的關系，結果顯示，E2F1表達與腦膜瘤患者的性別和年齡無明顯相關性;但3年內有14例患者出現復發性腦膜瘤，其中12例(86%)E2F1表達陽性，顯著高于無復發組患者(P<0.01)，見表1。

表1 E2F1表達與腦膜瘤臨床特征之間的關系

注：①與無復發比較，P<0.001。

3 討 論

腦膜瘤是一種常見的顱內腫瘤，約占顱內原發腫瘤的20%，根據WHO頒布的腦膜瘤分型標準可將腦膜瘤分為良性(Ⅰ級)、不典型(Ⅱ級)和惡性腦膜瘤(Ⅲ級)，其病理類型中Ⅰ級腦膜瘤約占90%，Ⅱ級腦膜瘤占4.7%～7.2%，Ⅲ腦膜瘤占1%～3%。腦膜瘤形成占位性病變，頭痛、癲癇、視力下降是其最常見的臨床癥狀[8]。手術是腦膜瘤目前主要治療手段，其他治療手段包括放療、化療、生物治療，總體預后佳。但部分腦膜瘤可表現為侵襲性生長，手術切除后容易復發，并可發生遠處轉移，術后腦膜瘤的復發和轉移是影響患者預后的關鍵因素。現階段大部分的回顧性研究認為Ⅱ級、Ⅲ級腦膜瘤復發率高，病理分級是影響預后的關鍵，其他預后因素包括年齡、性別、發生部位、治療方式等。目前關于腦膜瘤的發生發展以及惡性腦膜瘤的形成機制尚未研究清楚。

細胞周期一直是腫瘤研究領域中的熱點，正常細胞的增殖和分化受到精密的調控，其中p53和視網膜母細胞瘤(retinal blastoma，RB)家族蛋白是調控細胞周期的關鍵因子，也是重要的抑癌基因，其表達異常可導致細胞增殖不受控制，從而導致細胞發生致癌性轉變[9]。已經在多種人類腫瘤組織中發現p53和RB基因表達異常[10]。E2F家族蛋白作為一類重要的轉錄因子，普遍存在于高等真核生物中，包括哺乳動物、蠕蟲、果蠅和植物等，在進化上具有保守性[11]。在哺乳動物中，已經鑒定出8個E2F轉錄因子，其蛋白結構主要包括二聚化結構域(dimerization domain)和高度保守的DNA結合域(DNA-binding domain，DBD)。E2F轉錄因子家族是細胞內重要的調控蛋白，它們通過調節基因組DNA的轉錄進而調控細胞周期，同時又被細胞周期中一些重要蛋白所調控。因此，在細胞周期信號網絡中，E2F家族蛋白發揮著關鍵性的作用。雖然E2F家族成員的相應基因定位于不同的染色體，但是這些蛋白都包含有高度保守的DNA結合區，與DP蛋白結合的異二聚體區以及與RB蛋白家族成員結合區。E2F蛋白通過二聚化結構域與二聚化(dimerization partner，DP)蛋白形成異源二聚體，從而使E2F/DP能夠進入細胞核并獲得與特異性DNA序列結合的能力[12]；DBD能夠與特異性的DNA序列結合，對靶基因的轉錄進行調節[13]。E2F轉錄因子對細胞增殖相關基因的轉錄調節與RB家族蛋白緊密相關，RB蛋白通過與E2F蛋白的反式激活結構域結合，抑制E2F分子的轉錄活性[8]。其中E2F1屬于激活型E2F轉錄因子，主要調控細胞周期過程中的G1/S期轉換，使細胞進入S期，促進細胞的增殖。當細胞從G1期進入S期時，細胞周期蛋白D(cyclins D)及相關激酶可磷酸化RB，使RB與E2F蛋白分離，從而激活E2F的轉錄活性，對DNA復制相關基因的表達進行調節。

大量研究表明，E2F1參與了多種腫瘤的發生發展過程。E2F1在胃癌、結腸癌、乳腺浸潤型導管癌組織中表達均上調，過表達E2F1后可使細胞增殖活性增強，并誘導腫瘤細胞的形成[9]。本研究結果顯示，在腦膜瘤組織中，E2F1mRNA和蛋白水平明顯高于正常腦膜組織，并且不典型或惡性腦膜瘤組織中E2F1的表達水平顯著高于良性腦膜瘤組織，說明E2F1可能參與了腦膜瘤的發生過程。在靜止期細胞中，E2F1與RB蛋白結合，并以失活狀態存在于細胞質內，激活后可進入細胞核而發揮轉錄因子的活性。有研究顯示與正常腦膜組織相比，腦膜瘤組織中RB蛋白表達缺失[16]。本研究結果顯示腦膜瘤組織中E2F1蛋白主要定位在細胞核內，因此在腦膜瘤發生過程中，RB蛋白表達缺失后，對E2F1蛋白的抑制作用消失，E2F1可進入細胞核，通過調控細胞周期相關基因的表達而促進細胞增殖，從而促進腦膜瘤的發生和發展。根據腦膜瘤臨床分型的結果發現E2F1在不典型或惡性腦膜瘤組織細胞核中的陽性表達率顯著高于良性腦膜瘤。另外，腦膜瘤組織細胞核中E2F1的表達陽性率與患者的性別和年齡無明顯關聯，但3年內復發組腦膜瘤患者中腫瘤細胞核中E2F1表達陽性率顯著高于無復發組，進一步證實了E2F1可能參與了腦膜瘤的發展，并且與腦膜瘤的惡性行為有關。

綜上，轉錄因子E2F1可促進腦膜瘤的發生和惡性轉變，臨床上檢測E2F1的表達對判斷腦膜瘤的惡性程度具有輔助指導意義，并可作為預測患者是否復發的指標之一。

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Expression and clinical significance of transcriptional factor E2F1 in meningiomas

WANG Xianming1, ZHAO Juncang1, SU Yuqing1, TIAN Yunxiao1, JIANG Shuqin2

(1.The Central Hospital of Handan, Handan 056001,Hebei, China; 2.The Infectious Disease Hospital of Handan, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to observe the expression of transcriptional factor E2F1 and its clinical pathological significance in meningiomas.Methods 57 cases of meningiomas tissues diagnosed by pathological examination were included in this study, 38 cases of normal meninges tissues were used for control.Real-time PCR and Western blot were adopted for the quantification of E2F1 expression in meningiomas, immunohistochemistry was used to detect the E2F1 protein localization in meningiomas.The potential role of E2F1 in tumor classification and prognosis were analyzed.Results Real-time PCR results showed that E2F1 mRNA level was significantly higher than normal meninges tissues.Western blot results showed that E2F1 protein level was significantly higher than normal meninges tissues (P<0.01).Immunohistochemistry results revealed that E2F1 protein was mainly localized at nuclei meningiomas (P<0.01).The positive expression rate of E2F1 in meningiomas was 65 %, which was significantly higher than normal meninges tissues (P<0.01).In addition, the positive expression rate of E2F1 in atypical and malignant meningiomas was 73%, which was significantly higher than benign meningiomas (P<0.01).The positive expression rate of E2F1 in meningiomas recurrence group were markedly higher than non recurrence group (P<0.01).Conclusion E2F1 is highly expressed in meningiomas, and is positively correlated with malignancy grade and recurrence of meningiomas.

meningiomas; transcriptional factor E2F1; reoccurrence; cell cycle

王獻明，男,副主任醫師，研究方向為神經外科。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.09.008

R739.45

A

1008-8849(2015)09-0936-04

2014-10-15