NF-κB和VEGF在破裂顱內動脈瘤瘤壁的表達及相關性研究

曾 林

(瀘州醫學院附屬醫院，四川 瀘州 646000)

NF-κB和VEGF在破裂顱內動脈瘤瘤壁的表達及相關性研究

曾 林

(瀘州醫學院附屬醫院，四川 瀘州 646000)

目的 探討顱內動脈瘤患者破裂瘤壁組織中核因子κB(NF-κB)及血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平及相互關系。方法 對29例破裂顱內囊性動脈瘤標本(動脈瘤組)和30例腦外傷手術切除的顳極及顳葉皮質動脈血管標本(對照組)分別進行HE染色光鏡下觀察,并采用免疫組化染色法檢測2組標本組織中NF-κB及VEGF的表達情況，采用RT-PCR法檢測2組標本組織中NF-κBmRNA及VEGFmRNA的表達情況。結果 動脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達率及VEGFmRNA、NF-κBmRNA值均顯著高于對照組(P均<0.05)。動脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達情況具有顯著相關性(r=0.909，P=0.034)。結論NF-кB、VEGF在顱內破裂動脈瘤組織中高表達，并且二者間具有一定的正相關關系。

顱內動脈瘤；核因子κB；血管內皮生長因子

顱內動脈瘤是腦血管動脈管壁病理性局部凸起產生的，是造成腦血管出血的主要原因之一，其發病率在腦血管疾病中僅次于腦血栓及高血壓腦出血，而病死率高達70%，是一種嚴重威脅人類生命健康的疾病。顱內動脈瘤發生、發展和破裂的機制不明確，對該病的預防和治療造成了極大阻礙。核因子кB(NF-кB)是一種促炎癥基因表達的轉錄因子，可誘導炎癥反應中細胞因子、黏附分子、趨化因子、生長因子和一些炎性相關酶類等的表達[1]；而血管內皮生長因子(VEGF)是促血管生長最強的調節因子，可促進血管內皮細胞增殖和遷移，通過炎性浸潤和新生血管生成等機制促進粥樣硬化損傷的進展[2]。二者在腦血管動脈壁表達異常可能是瘤壁炎性反應以及病理學改變的重要原因。本研究通過比較破裂顱內囊性動脈瘤標本與腦外傷手術切除動脈血管標本的HE染色、免疫組化染色及NF-кB mRNA及VEGF mRNA的表達差異，研究NF-кB及VEGF在人顱內動脈瘤瘤壁中的表達情況，探討顱內動脈瘤的發病機制。

1 實驗資料

1.1一般資料 選取本院2011年11月—2014年12月收集的29例破裂顱內囊性動脈瘤標本為動脈瘤組,術前均經過CT、MRI檢查，術后經病理檢查確診；男16例,女13例；年齡27～55(44.62±7.94)歲；既往合并高血壓16例，高血脂14例，糖尿病10例，吸煙史13例；動脈瘤直徑(3.7±2.1)mm;大腦前動脈動脈瘤8例，中動脈動脈瘤6例，前交通動脈瘤8例，后交通動脈瘤5例，小腦后小動脈瘤2例。選擇30例腦外傷手術切除的顳極及顳葉皮質動脈血管標本作為對照組,均證實為非血管性病變;男18例,女12例；年齡21～57(45.27±10.29)歲。2組年齡、性別比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，均排除術前因顱內其他類型腫瘤實施放療或化療者。

1.2 方法 2組樣本均在無菌條件下獲得，用生理鹽水沖洗后，立即放入-80 ℃冰箱保存。樣本經甲醛固定后，分別以70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇中梯度脫水2～3 min，浸入無水乙醇Ⅰ中5 min、無水乙醇Ⅱ中10 min，然后浸入二甲苯Ⅰ、甲苯Ⅱ中分別透明10 min，最后進行石蠟包埋、切片，切片厚度4～5 μm。

1.2.1 HE染色 切片依次以二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟10 min后，浸入無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ中10 min；然后依次用95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇復水2～3 min，切片用蒸餾水中清洗后浸入蘇木素染液中染色2～5 min，流動水沖洗5 min后以0.5%鹽酸乙醇分化數秒，再以流動水清洗2 min后以0.5%伊紅水溶液染色5 min，最后依次浸入80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ靜置幾秒，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中靜置2～3 min后，用中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組化染色 ①石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，染色方法按試劑盒說明進行；②PBS漂洗3次，每次5 min，滴加30 mL/L過氧化氫室溫封閉10 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性；③加入修復液后微波熱修復10 min，PBS漂洗3次，每次5 min；④滴加VEGF或NF-κB一抗，抗體濃度為1∶1 000，37.5 ℃孵育30 min，45 ℃過夜；⑤滴加生物素標記抗的二抗，37.5 ℃孵育20 min，PBS沖洗；⑥滴加SABC工作液，37.5 ℃孵育30 min；⑦PBS沖洗，DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實驗中用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知VEGF和NF-κB陽性表達的顱內動脈瘤組織作為陽性對照。

1.2.3 RT-PCR法 取100 mg樣本放入消毒后的EP管中，剪碎后用DEPC水沖洗，加入1.0 mL Trizol 乳化20～30 s；混勻后置于15～30 ℃環境下5 min，使核蛋白解離，待組織塊完全解離后，加入0.2 mL氯仿震蕩，室溫靜置15～30 min后以12 000 r/min轉速離心15 min；離心后取上清液1.5 mL加異內醇0.5 mL，充分震蕩后室溫靜置15 min，12 000 r/min離心10 min后棄上清；沉淀加75%乙醇1 mL后以7 500 r/min轉速離心5 min，棄上清，重復步驟3后短暫離心，吸取殘留乙醇后使沉淀真空干燥；DEPC-treated water 20～50 μL溶解沉淀并以槍頭打勻，55～60 ℃孵育10 min后保存于-70 ℃冰箱；準備0.65 mL EP管，依次加入模板RNA 11 μL及O1igo(dT)18Primer 0.5 μg/μL，輕輕混勻后離心3～5 s，70 ℃水浴5 min，冰浴30 s，離心3～5 s；加入5×Reaction Buffer 4 μL、RNase Inhibitor(10 IU/μL)1 μL和dNTP Mix(10 mol/L)2 μL，終體積為20 μL；42 ℃水浴60 min；70 ℃水浴10 min，冷凍保存。按文獻[3]方法進行PCR。

1.3 免疫組化的結果判定標準 NF-кB陽性細胞為細胞核出現棕黃色著色，VEGF陽性為細胞質出現棕黃色染色，按照著色強度進行評分，無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐色3分；顯微鏡下染色陽性細胞計數：1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；2個得分項目相加為最終評分，總分<3分為(-)，即陰性表達；3分為(+)，弱陽性表達；4分為()，中陽性表達；5分為()，強陽性表達。

2 結 果

2.1HE染色結果 對照組動脈各層結構正常，內皮完整，內彈力膜存在，中膜平滑肌細胞有序排列,見圖1;動脈瘤組的血管壁可見平滑肌細胞減少，排列紊亂，纖維組織增生，炎性細胞浸潤,見圖2。

圖1 對照組HE染色結果

圖2 動脈瘤組HE染色結果

2.2 免疫組化染色結果 動脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達率顯著高于對照組(P均<0.05)，見表1及表2。動脈瘤組NF-κB、VEGF陽性表達情況具有顯著的相關性(r=0.909，P=0.034)，見表3。

表1 2組NF-κB陽性表達情況 例(%)

注：①與對照組比較，P<0.01。

表2 2組VEGF陽性表達情況 例(%)

注：①與對照組比較，P<0.01。

2.3 RT-PCR檢測結果 動脈瘤組VEGF mRNA、NF-κB mRNA值顯著高于對照組(P均<0.05)。見表4。

表3 2組VEGF、NF-κB陽性表達相關性 例

表4 2組VEGF mRNA、NF-κB mRNA檢測結果比較

3 討 論

顱內動脈瘤是一種多發于中老年人群的致殘率和致死率都極高的腦血管疾病，該病在早期無明顯癥狀，隨著病情發展，一旦因瘤體破裂而突然發生出血，病情就會急劇惡化，患者通常預后不良[4]，因此對該病的早期診斷和干預就成為降低病死率、改善預后的重要途徑[5]。但目前醫學界尚無統一明確的預防和診斷方法，因此對于該病發病機制的研究以及在此基礎上探索防治顱內動脈瘤的有效方法，就成為當前攻克這一疾病的重中之重。

先天性血管壁發育不良和血管壁獲得性退行性病變以及兩者的共同作用是顱內動脈瘤發病機制的主要論點[6]，除此之外，高血壓、飲酒、創傷、感染等因素與動脈瘤形成也有一定聯系。近幾年，顱內動脈瘤與血管退行性病變相關的學說開始被提出，認為該病的發生與動脈粥樣硬化、衰老等因素有緊密聯系，根據動脈粥樣硬化、衰老的發生機制推斷，顱內動脈瘤的產生可能與細胞凋亡異常、細胞外基質的降解及擴張性重塑、免疫和炎癥損傷等過程有關[7]，顱內動脈瘤的形成、生長與破裂從本質上講就是血管重塑的過程，各種因子引起的炎癥反應貫穿病變始終，因此對細胞信號轉導、細胞外基質的降解及擴張性重塑、免疫和炎癥損傷等細胞因子的監測可能對于該病的早期診斷和預防有十分重要的意義[8]。

NF-кB是一種在免疫、炎癥、細胞凋亡過程中發揮調控作用的細胞因子，其通過誘導巨噬細胞、淋巴細胞等產生細胞因子、黏附分子、趨化因子、生長因子和一些炎性相關酶類等的表達參與炎癥反應調控，其異常激活與顱內動脈瘤的發生、發展有關[9]。Aoki等[10]研究發現，NF-кB在腦動脈瘤形成初期被激活，同時對下游基因的表達起上調作用，通過人為干預減少NF-кB后，腦動脈瘤的發生率明顯降低。有研究顯示[11]，正常動脈壁無炎細胞浸潤，而在產生動脈瘤的血管壁中卻存在大量炎性細胞，且這一變化存在于動脈瘤形成的整個過程，表現在免疫球蛋白和巨噬細胞的大量浸潤[12]，且單核巨噬細胞在顱內動脈瘤壁中廣泛浸潤，而并非僅僅存在于動脈粥樣硬化的病灶處，炎性細胞分泌的細胞因子可誘導血管壁的內皮細胞和平滑肌細胞的分泌發生改變，從而破壞動脈血管壁[13]。VEGF是促血管生長作用最強的調節因子，通過增強血管內皮細胞的增殖和遷移，誘導血管發生，增加血管通透性[14]。NF-кB高表達對血管壁的破壞和VEGF高表達對損傷血管的重塑共同促使了動脈瘤的形成[15]。本研究結果顯示，動脈瘤組NF-кB及VEGF陽性表達率及NF-кB mRNA和VEGF mRNA值均明顯高于對照組。

綜上所述，NF-кB和VEGF的異常表達與顱內動脈瘤的發生關系密切，對其表達水平的監測或能作為該病早期診斷和預后預測的指標，對于疾病的治療也提供了一定思路方法。但上述細胞因子在該病發病機制中扮演的角色尚不清楚，其異常表達的原因和控制方法仍然未知，因此需要進一步廣泛、深入研究。

[1] 李建峰.基質金屬蛋白酶-9和核因子-кB在顱內動脈瘤中的表達[J].中國現代醫學雜志,2014,24(13):37-39

[2] 鄒文萍,唐國強,李光明.VEGF及其受體的生物學特性[J].四川生理科學雜志,2012,34(3):123-126

[3] 韓磊.破裂顱內囊性動脈瘤NF-KB、VEGF的相關性表達與瘤壁血管重塑[D].濟南:山東大學,2008

[4] 閆傳真,關靖宇.重癥蛛網膜下腔出血患者腦脊液細胞因子與預后的相關性研究[J].現代儀器與分析,2014,5(3):34-36

[5] He ZZ,Huang GF.Effect of nuclear factor-Kappa B on pathogenesis of intracranial aneurysm[J].Practical Journal of Clinical Medicine,2011,8(5):185-188

[6] Zhao SH,Li LM,Ma WQ,et al.Expression of the matrix metalloproteinase-2 and 9 in intracranial aneurysms[J].Chinese Journal of Cerebrovascular Diseases,2013,10(1):18-21

[7] 周健，翟寶進，焦德讓.顱內動脈瘤與細胞外基質[J].武警醫學院學報，2007，16(4)：478-480

[8] 李明昌，石忠松，黃正松，等.顱內動脈瘤組織免疫和炎癥相關差異表達基因的研究[J].中華神經醫學雜志，2006，5(9)：911-913

[9] 朱佳蕾,鄧夏珩,高麗,等.白黎蘆醇通過核因子-кB信號通路抑制腦缺血基質金屬蛋白酶功能上調[J].中國老年學雜志，2013,33(5):1073-1075

[10] Aoki T,Kataoka H,Morimoto M,et al.Macrophage-derived matrix metalloproteinase-2 and-9 promote the progression of cerebral and aneurysms in rats[J]． Strok,2007,38(1):162-169

[11] Vlak MH,Algra A,Brandenburg R,et al.Prevalence of unruptured intracranial aneurysms,with emphasis on sex,age,comorbodity,country,and time period:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Neurol,2011,1(10):626-636

[12] 梅其勇,白如林,黃承光,等.巨噬細胞參與顱內動脈瘤發病機制的研究進展[J].神經損傷與功能重建,2014,9(1):56-58

[13] Kanematsu Y,Kanematsu M,KURIHARA C,et al.Critical roles of macrophages in the formation of intracranial aneurysm[J].Stroke,2011,42(1):173-178[14] 呂倩,王昌明,蔣明,等.HIF-1ɑ和VEGF在大鼠COPD中的表達及與肺血管重構的關系研究[J].中國藥理學通報,2012,28(6):772-777

[15] Naggara ON,White PM,Guilbaert F,et al.Endovascular treatment of intracranial unruptured aneurysms：systematic review and meta-analysis of the literature on safety and efficacy[J].Radiology,2010,256(13)：887-897

Expression of NF-kB and VEGF in ruptured intracranial aneurysm wall and correlation study

ZENG Lin

(Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,China)

Objective It is to explore the expression of nuclear factor kappa B (tissue NF- kappa B) and vascular endothelial growth factor (VEGF)in ruptured intracranial aneurysm wall and the correlation between them.Methods 29 cases of ruptured intracranial aneurysms specimens (aneurysm group) and 30 cases of resection of brain trauma operation of the temporal pole and cortex of temporal lobe artery specimens (control group) were collected and observed under light microscopy after HE staining.The expression of NF-κB and VEGF were detected by immunohistochemistry staining method,and the expression of NF-κB mRNA and VEGF mRNA were detected by RT-PCR method in the specimens in both groups.Results The positive expression rates of NF-κB and VEGF and the values of NF-κB mRNA and VEGF mRNA were significantly higher in aneurysm group than that of the control group (P<0.05).There was significant correlation between the expression of NF-κB and VEGF (r=0.909,P=0.034).Conclusion There are high expression of NF-κB and VEGF in the aneurysm rupture in intracranial tissues,and the expressions are positive correlated.

intracranial aneurysm; nuclear factor kappa B; vascular endothelial growth factor

曾林，男，研究生，研究方向為顱內動脈瘤診治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.13.008

R543.5

A

1008-8849(2015)13-1391-04

2014-12-24