電針后外敷威靈仙浸膏治療日本大耳白兔實驗性膝骨關節炎的研究

李 敏，丁武華，李 莉，方 偉，郭俐宏

(1.湖北省十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬醫院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000)

電針后外敷威靈仙浸膏治療日本大耳白兔實驗性膝骨關節炎的研究

李 敏1，丁武華1，李 莉2，方 偉2，郭俐宏2

(1.湖北省十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬醫院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000)

目的 研究電針配穴聯合自制威靈仙浸膏外敷治療實驗性日本大耳白兔膝骨關節炎合并關節腔積液的效果及作用機制。方法 將日本大耳白兔36只隨機分為模型組、電針組、威靈仙組及聯合組，4組均于第1，3，7天各注射1次弗氏完全佐劑(0.1 mL)于左膝關節腔內造模；造模成功后電針組取足三里、血海、陽陵泉為主穴電針刺激30 min,威靈仙組于膝骨關節處每日涂抹威靈仙浸膏,聯合組在電針足三里、血海、陽陵泉30 min后膝骨關節處每日涂抹威靈仙浸膏,均治療2周。分別于造模前及治療后2周測定關節積液中炎癥遞質前列腺素E2(PGE2)、透明質酸(HA)、白細胞介素-1β(IL-1β)水平；計算足趾關節腫脹率及消腫時間，并于治療結束后取動物關節軟骨測定軟骨MMP-1細胞陽性表達率。結果 治療2周后，聯合組PGE2、IL-1β水平,MMP-1細胞陽性表達率及足趾關節腫脹率均明顯低于治療前及電針組、威靈仙組(P均<0.05),消腫時間明顯短于電針組、威靈仙組(P均<0.05)，HA水平高于電針組、威靈仙組(P均<0.05)。結論 電針配穴聯合自制威靈仙浸膏外敷治療日本大耳白兔實驗性膝骨關節炎合并關節腔積液效果好。其作用機制可能是電針刺激可激發經氣，降低痛閾，威靈仙浸膏經皮吸收后可促進局部血液循環及局部病變組織新陳代謝，增加HA分泌，抑制IL-1β的合成，二者協同促使病變組織恢復，減輕關節疼痛。

威靈仙浸膏；膝骨關節炎;前列腺素E2；透明質酸；軟骨MMP-1細胞

中醫學認為，膝骨關節炎是由于膝關節局部濕濁痹阻及血瘀氣滯而起，歸“骨痹”“筋痹”范疇，治當利濕除痹、舒筋通絡、活血化瘀、行氣止痛[1]。當膝關節滑膜受到勞損、外傷、感染等刺激后，滑膜下層毛細血管擴張，毛細血管通透性增大，致使關節內產生大量滲出液，出現關節積液[2]。威靈仙為毛莨科植物威靈仙干燥根及根莖，《本草綱目》記載威靈仙“味微辛咸”，通經絡、消痰涎、祛風濕、散癖積[3],藥性辛散溫通，通行十二經脈，既能祛風濕，又能通經止痹痛。其主要有效成分為常春藤皂苷元及齊墩果酸，具有清熱、消炎抑菌、強心、利尿作用[4]。本實驗采取電針配穴聯合自制威靈仙浸膏外敷治療實驗性日本大耳白兔膝骨關節炎合并關節腔積液，以期研究聯合治療的鎮痛消炎作用機制，為臨床提供安全可靠的治療膝骨關節炎合并關節腔積液治療方案。

1 實驗資料

1.1實驗動物及分組 日本大耳白兔36只，體質量(2 500±50)g，雌雄兼用，實驗動物由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK(鄂)2011-0008；實驗動物設施使用許可證：SYXK(鄂)2011-0031。采用隨機數字表編號，隨機分為模型組、電針組、威靈仙組及聯合組，每組9只。

1.2 儀器設備及藥品試劑 SDZ-Ⅱ型電子針療儀(上海坤弘)；弗氏完全佐劑(上海實生細胞生物技術有限公司)；生理鹽水；威靈仙浸膏組方及自制方法：威靈仙10 g、透骨草30 g、當歸20 g、川烏10 g、海桐皮30 g、紅花15 g、伸筋草30 g、川牛膝15 g、艾葉10 g、木瓜15 g、草烏10 g、桂枝10 g、防風10 g碾成粉末(藥材由太和醫院中藥房提供)，混合凡士林并加少許香油調成糊狀備用。

1.3 動物模型制備 造模時先剃掉兔膝關節及以下毛發，碘伏消毒，采用日本鬼頭康彥膝骨關節炎造模法[5]，將弗氏完全佐劑0.1 mL于第1，3，7天注入左膝關節腔內，根據臨床上超疲勞容易提前出現骨關節炎的發病特點，每日強迫動物活動30 min，14 d后出現以下與臨床急性膝關節炎表現一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關節炎模型造模成功：①關節及其周圍僵硬、活動受限；②關節出現紅、腫、熱、痛，同時軟組織腫脹或積液；③發病的部位常見于膝、髖、踝等關節處；④關節積液檢查出現白細胞介素-1β(IL-1β)降低、透明質酸(HA)含量明顯升高；⑤關節病理切片鏡檢出現關節腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關節炎臨床病理學改變。

1.4 治療方法 將兔固定于兔固定器，電針組取足三里、血海、陽陵泉為主穴，用一次性無菌針灸針齊刺，旁開1寸兩旁各刺1針，其針尖與正中一針的針尖匯合，刺入骨膜，行導氣手法，使針感向膝周擴散為佳；以齊刺點為正極，配穴為負極，接 SDZ-Ⅱ型電子針療儀，連續波，頻率10 Hz，留針30 min。威靈仙組僅將威靈仙浸膏均勻涂抹在無菌紗布上，覆蓋于兔膝部并用彈性繃帶包扎。聯合組先給予電針組相同治療，在電針齊刺完成后，將威靈仙浸膏均勻涂抹在無菌紗布上，覆蓋于兔膝部并用彈性繃帶包扎。模型組每日僅消毒。以上治療1次/d，14 d為1個療程。

1.5 檢測指標及方法 ①于治療前后分別抽取兔膝關節腔積液，測定積液中前列腺素E2(PGE2)、IL-1β、HA含量。②病理檢查患者軟骨MMP-1陽性表達率(陽性細胞數/細胞總數×100%)。③計算膝關節腫脹百分率。方法：先取100 mL量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用50 mL注射器吸取量筒內蒸餾水約30 mL。于每只兔左膝關節縫矢狀面用記號筆做一標記，然后把兔左足緩慢伸入量筒內，使標記與量筒最高處平齊。再用已吸入30 mL水的注射器向量筒內緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及兔膝關節標記處一致，讀取注射器內剩余液體體積，再用30 mL-注射器內剩余液體體積即為兔的左膝關節容積，重復3次取平均值。左膝關節腫脹百分率(%)=(造模后容積-造模前容積)/造模前容積×100%。

2 結 果

2.1治療前后各組PGE2、IL-1β、HA水平及MMP-1陽性表達率比較 治療后電針組、威靈仙組、聯合組PGE2水平及MMP-1陽性表達率均低于本組治療前及模型組(P均<0.05)，威靈仙組與電針組比較差異無統計學意義；聯合組PGE2、IL-1β水平及MMP-1陽性表達率均明顯低于電針組及威靈仙組(P均<0.05)，HA明顯高于電針組及威靈仙組(P均<0.05)；電針組HA有一定的升高，IL-1β有降低趨勢，但與本組治療前及模型組比較差異無統計學意義；威靈仙組HA高于本組治療前及電針組(P均<0.05)， IL-1β明顯低于本組治療前及電針組(P均<0.05)。見表1。

2.2 治療前后各組足腫脹度及消腫時間比較 治療后電針組、威靈仙組、聯合組足腫脹度明顯低于本組治療前及模型組(P均<0.05)。威靈仙組與電針組足腫脹度及消腫時間比較差異無統計學意義。聯合組足腫脹度及消腫時間明顯低于電針組及威靈仙組(P均<0.05)。見表2。

3 討 論

膝關節炎常出現關節積液，其病理改變為關節腔及滑膜炎性浸潤，造成關節面軟骨被破壞、變性并繼發滑液炎癥，是關節軟骨細胞的分解與合成代謝紊亂造成的慢性、退行性關節疾病[6]。臨床上多發于35歲以上的中年人，臨床以膝關節疼痛、變形和活動受限為主要特點，目前治療多以抗炎、消腫為主，但療效并不理想。中醫認為，當膝關節因外傷或其他原因受損傷后，局部關節血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝，針灸可以舒筋通絡、行氣止痛，中藥內服外敷可以活血化瘀、利濕除痹，聯合應用效果較好[7]。本研究所選的陽陵泉穴可強筋祛濕，主治膝痹；足三里具有養血益氣之功效，主治下肢痿痹；血海穴主活血，與陽陵泉及足三里配伍具有舒筋活絡、利通關節之奇效。且電針刺激可激發經氣，降低痛閾，減輕關節滑膜表面神經末梢對炎性因子IL-1β、PGE2刺激的反應敏感度[8]。而中藥威靈仙有活血化瘀、祛風除濕、消腫抗炎鎮痛作用，能改善關節腔內環境而達“通則不痛”的功效；且威靈仙浸膏吸收后可促進局部組織血液循環及新陳代謝，促使滑膜內襯B型滑膜細胞和單核吞噬細胞大量分泌HA，達到潤滑關節、延緩軟骨退變及保護關節軟骨的作用；還可抑制機體產生過多的IL-1β及PGE2等炎癥因子，減輕對關節軟骨細胞的破壞，減少關節內滲出液[9-10]。

表1 治療前后各組PGE2、IL-1β、HA水平及MMP-1陽性表達率比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與聯合組比較，P<0.05；④與電針組比較，P<0.05。

表2 治療前后各組足腫脹度及消腫時間比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與聯合組比較，P<0.05。

正常的關節滑液中僅含有微量的IL-1β，但在膝關節骨性關節炎合并關節腔積液時，IL-1β的含量則會異常增高。PGE2是機體的主要炎癥因子和重要的細胞生長和調節因子，是花生四烯酸環氧合酶代謝產物，為二十碳不飽和脂肪酸，當出現感染時，PGE2大量產生。HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖單位有規律重復構成的大分子鏈狀多糖，是關節滑液和軟骨基質的重要組成部分。HA可減少膝關節炎關節內PGE2等炎性遞質的合成及擴散，減輕滑膜的通透性及關節內滲液[11]。正常關節軟骨中MMP-1細胞陽性表達極低，在膝骨關節炎早期常出現關節滑液IL-1β、PGE2及MMP-1細胞陽性表達率升高及HA降低的現象。故本實驗研究采用電針聯合威靈仙浸膏外敷治療膝骨性關節炎合并關節腔積液動物模型，以IL-1β、HA、PGE2及MMP-1細胞陽性表達率為主要生化指標來衡量該治療方案的療效。

本研究結果顯示，聯合組PGE2、IL-1β水平及MMP-1陽性表達率均明顯低于電針組及威靈仙組，HA明顯高于電針組及威靈仙組。提示電針刺激并配合威靈仙浸膏外敷聯合治療可減少炎癥因子PGE2、IL-1β的產生，抑制MMP-1的陽性表達，促進HA的分泌，療效明顯優于單用電針刺激或威靈仙浸膏外敷法，對臨床治療膝關節炎合并關節積液有一定的參考價值。

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Experimental study on external application of Clematis chinensis extract after acupuncture treatment in Japanese big ear rabbits with experimental knee osteoarthritis

LI Min1,DING Wuhua1,LI Li2,FANG Wei2,GUO Lihong2

(1.Shiyan Taihe Hospital (Affiliated to Hubei Medical College),Shiyan 442000,Hubei,China; 2.Hubei Medical College,Shiyan 442000,Hubei,China)

Objective It is observe the effect of electro acupuncture combined with self-made Clematis extract by external application on the Japanese big ear rabbits of experimental knee osteoarthritis (KOA)with joint effusion,and to explore its anti inflammation mechanism.Methods 36 white rabbits were randomly divided into model group,electro-acupuncture group,Clematis group and combined treatment group.All the rabbits were given complete Freund's adjuvant (0.1 mL) in the left knee joint cavity one time on the first,third and 7th day to establish models of KOA.After the models successfully established,electro-acupuncture group was treated with electro-acupuncture at Zusanli,Xuehai,Yanglingquan for 30 min; Clematis group was treated with Clematis extract on knee joint daily by external application; combined treatment group was treated with both electro-acupuncture and Clematis extract.All the treatment lasted for 2 weeks.The levels of PGE2,HA,IL-1β in joint effusion were determined before model establish and 2 weeks after treatment in all groups; toes swelling rate and swelling time of joint were counted,and the animal articular cartilage was gotten to detect the positive expression rate of MMP-1 cartilage cells at the end of treatment.Results After 2 weeks' treatment,the levels of PGE2,IL-1β,the positive rate of expression of MMP-1 cell rate and the toe joint swelling rate were significantly lower than that before treatment and the other two groups,swelling time was shorter while the level of HA was higher in combination group compared with that in the other two groups.Conclusion Electro-acupuncture combined with self-made Clematis extract topical therapy can be effective in the treatment of Japanese big ear rabbits of experimental knee osteoarthritis with joint effusion.The mechanism may be that: electro-acupuncture can arouse the Qi and decrease pain threshold,the extract can promote the local blood circulation and local tissue metabolism,increase the secretion of HA,inhibit IL-1β production,thus to promote the recovery of pathological tissue and relive joint pain together.

Clematis extract; knee osteoarthritis; prostaglandin E2; hyaluronic acid; MMP-1 cell

李敏，女，研究方向為中醫藥藥理及護理。

李莉，E-mail：951777718@qq.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.13.009

R-332

A

1008-8849(2015)13-1394-03

2014-12-01