腸益煎對裸鼠結腸癌移植瘤抑瘤作用的實驗研究

吳婷婷,王燕瑩,鐘 薏,張士強,曹晟丞,張海盛

(1. 上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院,上海 200080；2. 山東省淄博市中西醫結合醫院，山東 淄博 255000；3. 上海市松江區方塔中醫醫院，上海 201600)

腸益煎對裸鼠結腸癌移植瘤抑瘤作用的實驗研究

吳婷婷1,王燕瑩2,鐘 薏1,張士強1,曹晟丞3,張海盛3

(1. 上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院,上海 200080；2. 山東省淄博市中西醫結合醫院，山東 淄博 255000；3. 上海市松江區方塔中醫醫院，上海 201600)

目的 探究腸益煎對移植性結腸癌裸鼠腫瘤的抑制作用。方法 將接種人結腸癌LOVO細胞懸液于裸鼠皮下成功制備的裸鼠移植性結腸癌模型60只隨機分為模型組(A組)、腸益煎組(B組)、5-氟尿嘧啶組(C組)、5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(D組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶組(E組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(F組)，每組10只，模擬臨床給藥。A組給予生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃；其他組中腸益煎采用水煎劑12.5 g/(kg·d)灌胃，均每天1次，共14 d；5-氟尿嘧啶及奧沙利鉑采用腹腔注射，隔天1次，共5次。療程中觀察并記錄裸鼠體質量。療程結束后 處死裸鼠，采集標本，記錄瘤質量，計算腫瘤指數和抑瘤率。結果 裸鼠去瘤后質量B、C、D、E、F組均顯著高于A組(P均<0.05)，D、E、F組均顯著高于B、C組(P均<0.05)，D、E、F組間比較差異均無統計學意義；C、D、E、F組裸鼠瘤質量、腫瘤指數明顯低于A、B組(P均<0.05)，D、F組明顯低于C組(P均<0.05)。C、D、E、F組抑瘤率均明顯高于B組(P均<0.05),D、F組明顯高于C組(P均<0.05)。結論 中藥復方腸益煎可以穩定患瘤裸鼠體質量，有一定的抑制腫瘤瘤體生長作用，聯合化療藥物5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑抑瘤效果更佳。

腸益煎;腸癌;腫瘤指數;抑瘤率;裸鼠

大腸癌是世界第4位的惡性腫瘤[1]，目前主要治療方式為手術切除，而手術后的高復發轉移率一直是近年來大腸癌治療的瓶頸，故降低術后復發轉移非常重要。5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑是大腸癌根治術后廣泛應用的化療藥物，而中藥復方具有降低化療的毒副反應、影響細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、改善免疫功能、多靶點綜合治療等作用。本實驗建立人結腸癌LOVO細胞的皮下移植瘤模型，旨在觀察中藥腸益煎及腸益煎聯用化療藥物對腫瘤的抑制作用，為其臨床應用提供依據。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 4～5周齡BALB/c雌性裸鼠60只，體質量20～24 g，由中科院上海斯萊克實驗動物有限公司提供，于無特定病原體(SPF)環境飼養。實驗動物合格證號：SCXK(滬)2009-0069。

1.2 腫瘤細胞株 人結腸癌細胞LOVO細胞，由上海中科院提供。

1.3 實驗藥物 中藥復方腸益煎由黨參、茯苓、白術、土茯苓、菝葜、八月札、雞內金、陳皮等組成，由上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房提供。1640培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、HEPES(GIBCO)；DAB 、EDTA(Sigma)；MTT試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。5-氟尿嘧啶注射液(5-Fu,上海旭東海普藥業有限公司,批號：FA120912，規格：250 mg/支)。奧沙利鉑注射液(L-OHP，江蘇恒瑞藥業有限公司，批號：11112711，規格：250 mg/支)。

1.4 儀器 超凈工作臺(Bio-Hazard型，造鑫企業有限公司)；CO2細胞培養箱(B5060EK/CO2，德國Heraeus)；倒置顯微鏡(上海光學儀器廠)；4 ℃冰箱(得貝FF40，青島電冰箱廠)；低溫冰箱(MDF-292，SANYO CO。)；高壓蒸氣消毒器(上海醫用核子儀器廠)；電子分析天平(上海天平儀器廠)。

1.5 實驗方法

1.5.1 裸鼠移植瘤模型的建立 人結腸癌LOVO細胞，使用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素的1640培養基，培養于37 ℃含5%CO2培養箱中，細胞貼壁生長，至70%～80%融合時采用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA液消化傳代，調整細胞數為1.25×1010L-1，每只裸鼠皮膚消毒后以1 mL注射器于左下肢皮下注射0.2 mL細胞懸液，接種細胞2×106個/只，共60只。

1.5.2 分組與干預方法 待移植瘤平均直徑約5 mm后(細胞種植后第16天)，將全部裸鼠以隨機數字表法分為模型組(A組)、腸益煎組(B組)、5-氟尿嘧啶組(C組)、5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(D組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶組(E組)、腸益煎+5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑組(F組)，每組10只。腸益煎采用水煎劑12.5 g/(kg·d)灌注，共14 d；5-氟尿嘧啶及奧沙利鉑劑量參照成人體表面積換算，藥物劑量換算公式：dB=dA×(RB/RA) ×(WA/WB)1/3，采用腹腔注射，隔天1次，共5次。A組給予等量的生理鹽水灌胃14 d，0.2 mL/10 g。第16天處死裸鼠。

1.6 檢測指標 給藥前及給藥后第5天、第9天、第13天觀察并記錄裸鼠體質量。第16天處死裸鼠，采集標本，記錄瘤質量，計算腫瘤指數(腫瘤指數=瘤質量/去瘤后鼠質量)、抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-治療組平均瘤質量/模型組平均瘤質量)×100%。

2 結 果

2.1 各組體質量比較 裸鼠去瘤后，B、C、D、E、F組體質量均顯著高于A組(P均<0.05)，D、E、F組顯著高于B、C組(P均<0.05)。給藥第5天，D、E、F組體質量顯著高于A組(P均<0.05)，B、C組顯著高于D組(P均<0.05)；第9天，D、E、F組明顯高于A、B組(P均<0.05)，D組高于C組(P<0.05)；第13天，D、E、F組明顯高于A、C組(P均<0.05)，D組高于B組(P<0.05)。見表1。

表1 各組裸鼠體質量、去瘤后體質量比較

注：①與A組比較，P<0.05；②與B相比較，P<0.05；③與C組比較，P<0.05。

2.2 各組瘤質量、腫瘤指數及抑瘤率比較 C、D、E、F組裸鼠瘤質量、腫瘤指數均明顯低于與A、B組(P均<0.01)；D、F組明顯低于C組(P均<0.05)。C、D、E、F組抑瘤率均明顯高于B組(P均>0.05),D、F組明顯高于C組(P均<0.05)。見表2。

注：①與A組比較，P<0.05;②與B組比較，P<0.05;③與C組比較，P<0.05。

3 討 論

隨著人民生活水平的提高，結直腸癌的發病率正在大幅提高。目前，手術切除為大腸癌的根治性治療措施，但50%大腸癌患者于手術根治后2年內可出現復發或轉移[2]，術后3年復發轉移率高達95%[3]，這成為影響腸癌患者術后生存率的至關重要的因素。

歷代醫家就腸癌病機和治療多有闡發，《靈樞·五變》云：“人之善病腸中積聚者……皮膚薄而不澤，肉不堅而淖澤，如此則腸胃惡，惡則邪氣留止，積聚乃傷。”腸癌術后，患者正氣已虛，脾失健運，水谷不化，氣血乏源，濕濁壅滯，久而化熱，濕熱內蘊。中醫中藥治療以扶正為本，兼施以清熱化濕。中藥復方是以中醫藥理論為基礎，采用君臣佐使的復方配伍法則及靈活多樣的炮制方法，具有毒副作用小、綜合調節人體陰陽平衡等特點，能通過多靶點發揮抗腫瘤作用，逐漸為學界和大眾所認可。楊靜[4]使用健脾導滯法(黨參、蒼術、白術、豬苓、茯苓、薏苡仁、枳實、厚樸、黃柏、紅藤、敗醬草、虎杖、白花蛇舌草、炒谷芽、炒麥芽)聯合化療治療晚期腸癌，發現中藥聯合化療能改善患者癥狀、體力情況，提高患者的生活質量及免疫功能，減少患者感染的機會。張青等[5]將120例晚期大腸癌患者隨機分成治療組60例和對照組60例，治療組采用固本消瘤膠囊聯合FOLFOX4方案治療，對照組僅采用FOLFOX4方案化療，治療4個周期后治療組的臨床受益率和1年生存率均明顯高于對照組。蔣益蘭等[6]研究發現健脾消癌飲(黨參、白術、茯苓、黃芪、靈芝、薏苡仁、仙靈脾、丹參、白花蛇舌草、七葉一枝花、半枝蓮、石見穿、莪術、法夏、廣木香、炒枳殼)配合化療能降低大腸癌術后的復發轉移，延長生存期。可見，中醫中藥配合化療已成為大腸癌術后重要的治療方式。

腸益煎以益氣健脾、清熱化濕為治療原則，組方嚴謹、科學、合理，符合中醫理論。方中取四君子湯益氣健脾；土茯苓、菝葜清熱化濕；八月扎、陳皮、雞內金理氣健脾。各藥物在作用上相輔相成，具有協同作用，共奏健脾益氣、扶正解毒之功。多聯合化療，可降低結直腸癌術后復發轉率，改善患者術后生存質量[7]。

本實驗結果發現中藥復方腸益煎可以穩定患瘤裸鼠體質量，聯合化療藥物5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑能夠增加抑制腫瘤瘤體生長之效，發揮抑瘤作用，具體分子機制還有待進一步研究。

[1] 全國腫瘤防治研究辦公室,全國腫瘤登記中心,衛生部疾病預防控制局. 中國部分市、縣惡性腫瘤的發病與死亡(第3 卷)[M]. 北京: 人民衛生出版社,2007

[2] 孫燕. 內科腫瘤學[M]. 北京：人民衛生出版社,2001：623-624

[3] Park YJ，Park KJ，Park JG,et al. Prognosis factor in 2230 Korean colorectal cancer patients:analysis of consecutively operated cases[J]. World J Surg,1999,23(7):721-726

[4] 楊靜. 健脾導滯法聯合化療治療晚期腸癌臨床觀察[J]. 實用中醫內科雜志，2008,22(8):30-31

[5] 張青,王笑民,楊國旺,等. 固本消瘤膠囊聯合 FOLFOX4化療方案治療晚期大腸癌的臨床研究[J]. 北京中醫藥,2010,29(4):255-257

[6] 蔣益蘭,潘敏求,蔡美. 健脾消癌飲配合化療拮抗大腸癌術后復發轉移62例總結[J]. 湖南中醫雜志，2007,23(1):1-3

[7] 王文海，周榮耀. 腸益煎治療大腸癌術后50例臨床觀察[J]. 浙江中西醫結合雜志，2000，10(6)：325-326

Experimental study on anti tumor effect of Changyi Decoction on nude mice with transplanted colorectal cancer

WU Tingting1, WANG Yanying2, ZHONG Yi1, ZHANG Shiqiang1, CAO Shengcheng3, ZHANG Haisheng3

(1.Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai University of TCM, Shanghai 200082; 2.Zibo Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine, Zibo 255000, Shandong, China; 3.Fangta TCM Hospital of Songjiang District, Shanghai 201600, China)

Objective It is to investigate the anti rumor effect of Changyi Decoction on nude mice with transplanted colorectal cancer (CRC). Methods 60 nude mice with inoculation by transplant Colorectal Carcinoma LOVO cell suspension under their skin were randomly divided into 6 groups as model control group (Group A), Changyi Decoction group (Group B), 5-Fluorouracil group (Group C), 5-Fluorouracil+Oxaliplatin group (Group D), Changyi Decoction+5-Fluorouracil group (Group E) and Changyi Decoction+5-Fluorouracil+Oxaliplatin group (Group F), 10 mice in each group. Simulating the clinic, the mice were treated with normal saline (NS) in Group A, Changyi Decoction in Group B, 5-Fluorouracil (5-Fu) in Group C, 5-Fluorouracil and Oxaliplatin (L-OHP) in Group D, Changyi Decoction and 5-Fu in Group E, Changyi Decoction, 5-Fu and L-OHP in Group F. NS and Changyi Decoction were given by gavage once a day for 14 days with NS 20 mL/(kg·d) and Changyi Decoction 12.5 g/(kg·d). 5-Fu and L-OHP were given every other day by intraperitoneal injection for 5 times. In the course, mice weights were recorded. After treatment, the tumor weight was measured and tumor growth and inhibition rate were calculated. Results Mice weight after tumor removing of Group B, C, D, E and F were all markedly higher than that of Group A (allP<0.05), and which in Group D, E, F were higher markedly than those in Group B and C (allP<0.05), there was no significant difference among Group D, E and F (P>0.05). The tumor weight and tumor growth rate of Group C, D, E and F were lower markedly than those of Group A and B (allP<0.05), and which of Group D and F were higher markedly than that of Group C (P<0.05). The tumor inhibition?rate of Group B, C, D, E and F were higher markedly than that of Group B (allP<0.05), and which of Group D and F were higher markedly than that of Group C (allP<0.05). Conclusion Changyi Decoction can keep the weight of mice with CRC. It has some effect on tumor growth inhibition, and more effect to combine with chemotherapeutics such as 5-Fu and L-OHP.

Changyi Decoction; colorectal cancer; tumor growth rate; tumor inhibition rate; nude mice

吳婷婷，女，醫學碩士在讀，從事中醫治療惡性腫瘤相關研究。

鐘薏，E-mail:zhongzixian2000@163.com

上海市教委創新項目(12ZZ123)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.005

R-332

A

1008-8849(2015)12-1267-03

2014-11-05