CUMS所致大鼠抑郁行為的性別差異與HPA軸功能及BDNF表達相關性研究

蔣建新,成為榮,徐 西,楊 涌

(1. 廣西桂林市精神衛生中心,廣西 桂林 541001；2. 江蘇省南京腦科醫院,江蘇 南京 210029)

CUMS所致大鼠抑郁行為的性別差異與HPA軸功能及BDNF表達相關性研究

蔣建新1,成為榮2,徐 西2,楊 涌1

(1. 廣西桂林市精神衛生中心,廣西 桂林 541001；2. 江蘇省南京腦科醫院,江蘇 南京 210029)

目的 探討慢性輕度不可預見性刺激(CUMS)所致大鼠抑郁行為性別差異與下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(HPA)及腦源性神經營養因子(BDNF)表達的相關性。方法 選擇雌雄各半的遠交群SD大鼠64只，以隨機數字表格法為分配依據分雌性對照組、雄性對照組、雌性模型組以及雄性模型組，每組16只。應用CUMS以及孤養模式來建立大鼠抑郁模型。應用糖水消耗及高架迷宮法評估大鼠抑郁行為程度，應用Western-blot法檢測下丘腦促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)mRNA蛋白表達及轉錄水平，應用熒光定量PCR法檢測大鼠海馬BDNF mRNA蛋白表達及轉錄水平，應用放射免疫法檢測大鼠血清皮質酮(CORT)含量。結果 雌性模型組與雄性模型組高架迷宮開放臂次數、開放臂停留時間、糖水偏愛率、向下探究次數均顯著少于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)，血清CORT含量、下丘腦CRF mRNA蛋白表達及轉錄水平均明顯高于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)，而大鼠海馬BDNF mRNA蛋白表達及轉錄水平則明顯低于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)。雄性模型組大鼠進入高架迷宮開放臂與關閉臂次數、中央停留時間、糖水偏愛率、向下探究次數、血清CORT含量、下丘腦CRF mRNA蛋白表達及轉錄水平明顯低于雌性模型組(P均<0.05)，但關閉臂停留時間顯著長于雌性模型組(P<0.05)。結論 CUMS所致大鼠抑郁行為的性別差異與HPA軸功能及BDNF表達有密切關系，可為抑郁癥的防治及機制研究提供有力實驗依據。

大鼠；抑郁行為；下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸；腦源性神經營養因子

抑郁癥作為一種情感障礙性精神類疾病，具有高患病率以及高自殺率的特點，目前已經成為了世界性的第四大類疾病，據世界衛生組織的詳細統計，至2020年，抑郁癥會成為僅次于冠心病的世界第二大疾病[1]。流行病學的相關分析顯示，女性出現抑郁癥的概率要明顯高于男性，比例高達3∶1[2],目前抑郁癥性別差異的相關機制還不明確。近年研究發現,抑郁癥與促腎上腺皮質激素釋放因子(GRF)的分泌情況、血清皮質酮(CORT)的含量升高以及下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸功能的失調均有關聯[3-4]。HPA軸功能亢進患者，其腦源性神經營養因子(BDNF)表達明顯升高[5]，可見BDNF以及HPA軸在抑郁癥的發病中有重要作用。本研究應用慢性輕度不可預見性刺激(CUMS)方式建立大鼠模型，進而探討抑郁行為的性別差異與HPA軸功能及BDNF表達的關系，旨在為進一步尋找性別差異機制及預防措施提供參考依據。

1 實驗資料

1.1 動物 清潔級遠交群SD大鼠64只，雌雄各半，8周齡，體質量185～220 g。

1.2 試劑與儀器 蛋白定量BCA及蛋白裂解液購自博士德生物工程有限公司，CORT放射免疫試劑盒購自上海博研生物科技公司，山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(均為HRP標記)購自中杉金橋生物科技公司，兔抗鼠BDNF多克隆抗體以及ECL發光試劑盒分別購自美國的Milipore與Pierce公司，兔抗鼠CRF多克隆抗體與RNA抽提試劑盒分別購自美國的Abcam與OMEGA公司，凝膠成像系統、PCR儀、微量核酸定量儀購自美國Biorad公司，逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR購自日本TaKaRa公司。

1.3 動物及分組模型 取雌雄各半的64只大鼠，自由飲水攝食，并在通風良好的實驗室環境中適應性飼養1周后，按照隨機數字表格法將大鼠分為雌性對照組、雄性對照組、雌性模型組與雄性模型組，每組16只。保持正常的光照以及飲水攝食。雌性模型組與雄性模型組依照孤養以及CUMS方式建立抑郁模型，使用通宵與間歇照明法對大鼠進行刺激，光照法的光暗周期為2 h/2 h，同時選擇2 h噪聲、1 min夾尾、40～50 V電擊3 min、在4 ℃冰水中游泳5 min、禁水禁食24 h以上、在熱環境下5 min以及保持鼠籠傾斜角度45°超過24 h等共11種刺激方法，每日要隨機安排1種，每種刺激要重復2～3次，且不可連續性地出現同種刺激，整個刺激實驗周期為4周，在第29—30天分別進行高架迷宮與糖水消耗實驗。

1.4 大鼠行為學相關檢測

1.4.1 高架迷宮測試 高架迷宮的主要配件裝置包括底座(40 cm)、兩臂十字交叉(40 cm×10 cm)、中央格(10 cm×10 cm)，實驗環境需要安靜且明暗要合適，將參選實驗大鼠放進中央區域，并注意頭部要朝向開放臂，隨后要詳細記錄下在5 min內大鼠開放臂進入次數以及關閉臂進入次數，在開放臂、關閉臂及中央區域的停留時間，此外還有大鼠后肢的站立次數及開放臂向下探究的次數。

1.4.2 糖水消耗測試 在大鼠抑郁模型建立完成前，需要訓練大鼠在24 h飲用糖水10 g/L及純凈水，訓練成熟后可開始正式試驗。首先要予以大鼠禁食禁水24 h，隨后將大鼠放置于單籠中，保持環境的安靜和明暗舒適，然后予以大鼠0.6 L純凈水與10 g/L糖水，觀察1 h后大鼠純凈水及糖水的消耗量并記錄下來，計算糖水偏愛率：糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.5 血清CORT含量檢測 在各組中分別選取4只大鼠，取其靜脈血，3 000 r/min離心處理10 min，隨后將血清分離再于-20 ℃下保存，應用血清CORT放射免疫試劑盒測定其含量。

1.6 下丘腦CRF mRNA及海馬BDNF mRNA轉錄水平檢測 在各組中分別隨機取4只大鼠，斷頭后取其腦組織、下丘腦與海馬，每100 mg腦組織中加入1 mL RNAstore，并將下丘腦與海馬浸泡于其中，4 ℃下過夜后棄掉液體，下丘腦與海馬組織保存于-80 ℃下備用。應用熒光定量PCR法進行檢測，引物的設計可參照在GenBank中登陸的CRF、BDNF以及內參β-actin基因序列。大鼠海馬與下丘腦組織的總RNA可使用RNA抽提試劑盒進行提取，隨后予以逆轉錄合成為cDNA，并將其作為模板，行熒光定量PCR擴增，最后記錄CRF與海馬BDNF基因mRNA轉錄水平。

1.7 下丘腦CRF及海馬BDNF蛋白水平檢測 在各組中分別取4只大鼠，斷頭后取其腦組織，下丘腦與海馬分離，并將組織保存于-80 ℃下。應用BCA法測定腦組織勻漿總蛋白，含量，取樣品蛋白30 μg，分離處理后將其轉移至NC膜上，在室溫下于脫脂奶粉中封閉1 h，分離后在1∶1 000稀釋的條件下加入兔抗鼠CRF及BDNF多克隆抗體，同時加入1∶5 000稀釋條件下的山羊抗鼠β-actin單克隆抗體，在4 ℃下過夜保存，室溫下TBST洗滌處理2次，加入山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG(1∶3 000稀釋，均HRP標記處理)。在室溫下孵育2 h，隨后應用TBST洗滌2次，進行ECL顯色處理，最后使用Bio-Rad凝膠成像儀攝取凝膠圖像，隨后予以吸光度分析。

2 結 果

2.1 高架迷宮測試結果 雌性模型組與雄性模型組大鼠迷宮開放臂進入次數、開放臂停留時間以及向下探究次數均顯著少于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)，但關閉臂停留時間明顯長于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；雄性模型組大鼠迷宮開放臂以及關閉臂進入次數、直立及向下探究次數、在中央區停留時間均明顯少于雌性模型組(P均<0.05)，而關閉臂停留時間明顯長于雌性模型組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠的高架迷宮測試結果比較

注：①與雌性模型組比較，P<0.05；②與雄性模型組比較，P<0.05。

2.2 糖水消耗測試結果 雄性模型組糖水偏愛率為(28.22±35.33)%，雄性對照組為(84.98±9.10)%，2組比較差異有統計學意義(t=-12.467，P<0.05)；雌性模型組糖水偏愛率為(72.73±13.05)%，雌性對照組為(88.54±2.73)%，2組比較差異有統計學意義(t=7.843，P<0.05)；且雄性模型組糖水偏愛率顯著低于雌性模型組(t=8.389，P<0.05)。

2.3 血清CORT含量測定結果 雌性模型組血清CORT含量為(331.36±24.16)ng/mL，雌性對照組為(304.14±4.58)ng/mL，2組比較差異有統計學意義(t=-13.675，P<0.05)；雄性模型組CORT含量為(296.56±8.16)ng/mL，雄性對照組為(269.89±4.43)ng/mL，2組比較差異有統計學意義(t=8.733，P<0.05)。同時雌性模型組CORT含量明顯高于雄性模型組(t=-10.547，P<0.05)，雌性對照組CORT含量明顯高于雄性對照組(t=7.682，P<0.05)。

2.4 下丘腦CRF及海馬BDNF mRNA轉錄水平 雌性模型組與雄性模型組海馬BDNF mRNA轉錄水平明顯低于相對應的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；而雌性模型組與雄性模型組下丘腦CRF mRNA轉錄水平明顯高于相對應的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)。雌性模型組下丘腦CRF mRNA轉錄水平明顯高于雄性模型組(P<0.05)，雌性模型組大鼠海馬BDNF mRNA轉錄水平亦明顯高于雄性模型組大鼠(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠下丘腦CRF mRNA及海馬BDNF mRNA轉錄水平比較

注：①與雌性模型組比較，P<0.05；②與雄性模型組比較，P<0.05。

2.5 下丘腦CRF及海馬BDNF蛋白表達情況 雌性模型組與雄性模型組海馬BDNF蛋白表達水平顯著低于相對應的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；而雌性模型組與雄性模型組下丘腦CRF蛋白表達水平則明顯高于相對應的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；雌性模型組下丘腦CRF蛋白表達水平高于雄性模型組(P<0.05)，而雌性模型組海馬BDNF蛋白表達水平亦明顯高于雄性模型組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠下丘腦CRF 及海馬BDNF 蛋白表達水平比較

注：①與雌性模型組比較，P<0.05；②與雄性模型組比較，P<0.05。

3 討 論

CUMS在當前是十分典型的且比較常用的抑郁模型建立方法，抑郁癥的低水平、中慢性應激源促使病情發生或者加速的機制是其主要理論參考依據[6-7]。因此本研究通過孤養并結合COMS模式來建立大鼠抑郁模型，結果顯示，COMS雄性與雌性模型大鼠在高架迷宮、糖水消耗測試中均明顯表現出了焦慮抑郁的行為，且高架迷宮開放臂進入次數、開放臂停留時間以及向下探究次數雌性與雄性模型組大鼠明顯少于雌性與雄性對照組大鼠，可見模型組兩性大鼠的抑郁行為已經十分明顯，同時雄性模型組大鼠迷宮開放臂以及關閉臂進入次數、直立與向下探究次數、在中央區停留時間較雌性模型組降低更為明顯，可見雄性模型組大鼠的抑郁行為更為顯著。另外，兩性模型組大鼠的糖水偏愛率要明顯低于對應的對照組，且雄性模型組大鼠的糖水偏愛率較雌性模型組大鼠低，可見抑郁模型大鼠已經出現了明顯的興趣缺失，且雄性模型組大鼠的興趣缺失更為強烈，抑郁行為更加明顯。

HPA作為神經內分泌系統的重要成分，一旦發生應激情況，該軸的激活以及因此所引發的各種系列變化都是應激反應的重要特征。HPA軸亢進是慢性應激對機體造成損傷的一種重要體現和環節，其與抑郁癥的發生和進展有著密不可分的關系。血清CORT及CRF大量的分泌是HPA軸亢進的2個重要指標。本研究結果顯示，兩性模型組血清含量明顯高于兩性對照組，且雌性模型組CORT含量高于雄性模型組，雌性模型組CRF表達高于雄性模型組，雌性對照組CRF表達高于雄性模型組，但差異無統計學意義，提示女性抑郁癥的發病率要高于男性，這可能與女性患者CORT及CRF表達較高有關，

近年來的研究中發現，BDNF的表達有一定的抗抑郁作用，同時其在機體內的水平也可以作為反映重度抑郁患者治療與預后的指標[8]。在慢性應激刺激下，大鼠海馬BDNF表達有所減少，從而減弱了其對HPA軸的抑制影響。本研究結果顯示，兩性對照組大鼠BDNF表達情況比較差異無統計學意義，而兩性模型組BDNF表達較兩性對照組有所降低，可見CUMS對BDNF的表達有一定抑制作用，且雄性大鼠的BDNF表達水平明顯低于雌性大鼠，這可能與雄性大鼠抑郁行為重于雌性大鼠有關。

綜上所述，CUMS所致大鼠抑郁行為有明顯的性別差異，雄性大鼠明顯重于雌性大鼠，這與在接受應激刺激時大鼠海馬BDNF表達程度不同及HPA軸功能差異有關，為臨床治療及預防抑郁癥提供了有價值的參考依據。

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Study on the correlation between the gender difference in depressive behavior of rats induced by CUMS and function of HPA axis and BDNF expression

JIANG Jianxin1, CHENG Weirong2, XU Xi2, YANG Yong1

(1.Guilin Mental Health Psychiatric Center, Guilin 541001, Guangxi, China; 2.Nanjing Brain Hospital, Nanjing 210029, Jiangsu, China)

Objective It is to investigate the correlation between the gender differences in depressive behavior of rats induced by CUMS and hypothalamic pituitary adrenal axis (HPA) and brain derived neurotrophic factor (BDNF) expression. Methods 64 case of each half of the male and female of outbred group SD rats were selected, and divided into 4 groups by using random number table method as female control group, male control group, female model group and male model group with 16 rats in each group. The rat model of depression was built by CUMS and isolated feed mode. The degree of the depressive behavior of rats was valued by sugar consumption and elevated maze method. The protein expression and transcription level of corticotrophin releasing factor (CRF) mRNA in hypothalamus were detected by Western-blot method. The protein expression and transcription level of Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) mRNA in hippocampus were detected by fluorescence quantitative PCR. The content of serum corticosterone (CORT) of rats was detected by radioimmunoassay. Results The number of into open arm, residence time in opened arm, sucrose preference rate and times of down inquiry of male and female model groups were significantly decreased than that of female and male control group (allP<0.05); and the content of serum CORT and hypothalamus CRF protein expression and transcription level of mRNA were increased significantly than that of female and male control groups (allP<0.05); while the rat hippocampus BDNF protein expression and transcription level of mRNA were significantly decreased than that of female and male control groups (allP<0.05). The times of into elevated maze opened arm and closed arm, the central residence time, sucrose preference rate, times of down inquiry, serum CORT content, hypothalamus CRF protein expression and transcription level of mRNA in male model group were significantly lower than that in female model group (allP<0.05); but the closed arm retention time was significantly longer than that in female model group (P<0.05). Conclusion The gender differences in depressive behavior of rats induced by CUMS have close relationship with the expression of HPA and BDNF axis function; it can provide strong experimental evidence for the prevention and cure and study of mechanism of depression.

rats; depressive behavior; Hypothalamus-pituitary-adrenal axis; brain derived neurotrophic factor

蔣建新，男，主治醫師，主要從事雙相情感障礙的臨床和基礎研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.008

R-332

A

1008-8849(2015)12-1276-04

2014-12-20