砷脅迫下不同砷富集能力植物內(nèi)源生長(zhǎng)素與抗氧化酶的關(guān)系

胡擁軍, 王海娟, 王宏鑌, 楊曉燕, 李燕燕, 殷 飛

昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 昆明 650500

砷脅迫下不同砷富集能力植物內(nèi)源生長(zhǎng)素與抗氧化酶的關(guān)系

胡擁軍, 王海娟, 王宏鑌*, 楊曉燕, 李燕燕, 殷 飛

昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 昆明 650500

采用室內(nèi)土培法，研究了砷脅迫(0，50，100和200 mg/kg)對(duì)鳳尾蕨屬中砷超富集植物大葉井口邊草(Pteriscreticavar.nervosa)和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨(Pterisensiformis)生物量、株高、葉片內(nèi)源3-吲哚乙酸(IAA)含量、IAA氧化酶(IAAO)活性、砷含量、抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT)活性以及細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的影響，并用逐步回歸法分析了IAA 含量與砷含量、抗氧化酶活性、MDA含量之間的關(guān)系。此外，研究了100 mg/kg砷處理下IAA、IAAO、3種抗氧化酶和MDA的時(shí)間動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，與對(duì)照(不加砷)相比，加砷處理下大葉井口邊草的株高和生物量未出現(xiàn)顯著變化，但劍葉鳳尾蕨在中、高濃度砷脅迫下則顯著降低；中、高濃度砷脅迫均使2種植物葉片含砷量、IAA含量顯著增加和IAAO活性顯著下降，但這種改變?cè)诖笕~井口邊草中更為顯著；加砷處理使大葉井口邊草葉片3種抗氧化酶活性維持或增加，劍葉鳳尾蕨中SOD和CAT活性雖能維持，但POD活性則顯著下降，說明砷脅迫下大葉井口邊草具有更強(qiáng)的抗氧化能力。逐步回歸分析結(jié)果顯示，2種植物葉片IAA含量均與砷含量成顯著正相關(guān)，但在大葉井口邊草中，IAA含量還與CAT活性成顯著負(fù)相關(guān)。時(shí)間動(dòng)態(tài)研究表明，第13天，大葉井口邊草具有最高的IAA含量、最低的IAAO活性以及最低的CAT活性，而劍葉鳳尾蕨中的變化規(guī)律則不明顯。因此，葉片保持較高的IAA含量、較低的IAAO和CAT活性有助于大葉井口邊草超量富集砷。

生長(zhǎng)素; 3-吲哚乙酸(IAA); 砷; 抗氧化酶; 大葉井口邊草; 劍葉鳳尾蕨

自Ma等[1]、Chen等[2]發(fā)現(xiàn)鳳尾蕨屬植物蜈蚣草(Pterisvittata)能超富集砷以來，人們開始利用超富集植物去除土壤和水體中的砷，同時(shí)，圍繞蜈蚣草開展了很多該植物超富集砷的機(jī)理研究。目前國(guó)際公認(rèn)的砷超富集植物有12種，其中11種為鳳尾蕨屬植物，另1種為裸子蕨科粉葉蕨屬植物[3]。因此，砷超富集植物主要來源于鳳尾蕨屬。但是，并非鳳尾蕨屬植物都能超富集砷，人們也發(fā)現(xiàn)了幾種不能超富集砷的鳳尾蕨屬植物，如Pterisstraminea、Pteristremula[4]、劍葉鳳尾蕨(Pterisensiformis)[5]、半邊旗(Pterissemipinnata)[6]等。同屬中不同砷富集能力植物為比較生理學(xué)的研究提供了極好材料，國(guó)內(nèi)外有很多研究者運(yùn)用鳳尾蕨屬中不同砷富集能力植物作為供試材料，比較研究了兩類植物在砷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、耐性[7- 8]和根際特征[9]等方面的差異。

在理論上研究植物超富集砷機(jī)理、在實(shí)踐中注重提高植物砷富集量的同時(shí)，有一個(gè)不容忽視的問題是植物支撐其超富集砷的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。維持較好的生長(zhǎng)狀況和高生物量是實(shí)現(xiàn)植物修復(fù)技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要前提和基礎(chǔ)，而植物激素在其中起重要作用。植物激素在植物體內(nèi)的含量雖然十分微量，但其在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境生理研究中卻占據(jù)著重要地位。長(zhǎng)期以來，對(duì)脫落酸和乙烯的抗逆機(jī)理研究甚多，但近年來，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在植物抗逆研究中的作用和機(jī)理也備受關(guān)注。這兩類激素不同于其他植物激素的一個(gè)重要方面是：它們是植物存活所必需的。盡管其他植物激素可以作為調(diào)節(jié)植物某些特殊生長(zhǎng)發(fā)育過程的開關(guān)，但是植物自始至終都需要一定量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。在超富集植物中，這兩類激素的水平直接影響到植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況和生物量。

在重金屬脅迫下，外源添加生長(zhǎng)素對(duì)植物重金屬吸收和生理生化的影響，目前已有一些報(bào)道。Lpez等[10]通過添加100 μmol/L IAA(吲哚乙酸，indole- 3-acetic acid)+0.2 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸，ethylene diamine tetraacetic acid)，使非超富集植物紫花苜蓿(Medicagosativa)葉片對(duì)鉛的富集量增加了28倍；都瑞軍[11]對(duì)鋅/鎘超富集植物滇苦菜(PicrisdivaricataVant.)的研究表明，經(jīng)100 μmol/L IAA 處理，其葉片鉛富集量上升了46.5%；Liu等[12]在200 μmol/L 的含鉛培養(yǎng)液中添加100 μmol/L IAA后，在鉛富集植物東南景天(Sedumalfredii)的2種生態(tài)型中，地上部鉛含量顯著增加，但對(duì)根富集Pb無顯著影響；對(duì)豆科植物Sesbaniadrummondii的研究表明，添加100 μmol/L IAA或100 μmol/L NAA(萘乙酸，1-naphthlcetic acid)后，植物地上部Pb富集量分別增加了654%和415%[13]。Piotrowska-Niczyporuk等[14]研究了外源添加的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、茉莉酮酸和多胺對(duì)鎘、銅、鉛單一脅迫下一種綠藻(Chlorellavulgaris)生長(zhǎng)和新陳代謝的影響，發(fā)現(xiàn)除茉莉酮酸使重金屬吸收增加外，外源添加的幾種植物激素減緩了金屬離子的毒性。從已有的研究看，通過外源添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的研究偏多，比較超富集與非超富集植物內(nèi)源生長(zhǎng)素含量水平的研究尚少，目前尚缺少這兩類植物內(nèi)源激素水平是否存在差異的報(bào)道。

本研究通過室內(nèi)土培實(shí)驗(yàn)，研究砷超富集植物大葉井口邊草(Pteriscreticavar.nervosa)和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨(P.ensiformis)在不同濃度砷脅迫下葉片中吲哚乙酸(IAA)含量、IAA氧化酶(indole- 3-acetic acid oxidase, IAAO)和幾種抗氧化酶活性的變化，以及中等砷濃度(100 mg/kg)脅迫下IAA、IAAO和抗氧化系統(tǒng)的時(shí)間動(dòng)態(tài)，結(jié)合逐步回歸法揭示砷脅迫下兩種植物葉片內(nèi)源生長(zhǎng)素(IAA)的含量與抗氧化酶活性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：將昆明理工大學(xué)呈貢校區(qū)梨園土風(fēng)干過5 mm篩，取1/2梨園土、1/4河沙、1/4腐殖土進(jìn)行充分混勻，并加入N、P、K營(yíng)養(yǎng)元素作基肥(N∶P2O5∶K2O=0.15∶0.10∶0.15 g/kg土，干重)。供試土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physio-chemical characteristics of soil used (n=3)

—: 未檢出; 表中數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示

供試植物：砷超富集植物大葉井口邊草(P.creticavar.nervosa)和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨(P.ensiformis)初生小苗分別采自昆明理工大學(xué)校園和云南省紅河州河口縣附近橡膠林中。帶回溫室后進(jìn)行修剪并于清潔土壤中適應(yīng)性培養(yǎng)2個(gè)月，選取長(zhǎng)勢(shì)良好、大小一致的幼苗植株(8—9 cm高、帶7—8片小葉)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在供試土壤中進(jìn)行加砷處理，分別添加0、50、100和200 mg/kg 4個(gè)濃度(以Na3AsO4·12H2O形式加入，砷濃度以純砷計(jì))，平衡6周后裝盆(每盆1 kg)，每個(gè)處理重復(fù)3次。另外分別取6個(gè)大盆(每盆裝添加了100 mg/kg砷土壤20 kg)分為2組，分別種植2種植物，進(jìn)行2種植物相關(guān)指標(biāo)的時(shí)間動(dòng)態(tài)測(cè)定(從第1天開始，每7d取1次樣，直到第49天)。2種植物培養(yǎng)49d后收獲，先用自來水清洗，再用1%鹽酸浸泡10 min以去除植物表面附著的砷，最后用自來水和蒸餾水反復(fù)沖洗，用濾紙吸干植物表面水分，裝入自封袋，放入冰箱在-18 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣∫徊糠种参镉诤嫦?05 ℃殺青30 min，在70 ℃下烘干至恒重，磨碎混勻，稱取0.2 g左右樣品，用HNO3-H2O2在130 ℃下加熱消化，經(jīng)過濾、定容后測(cè)定植物砷含量。

1.3 測(cè)定方法

植物砷含量測(cè)定參照馬麗等[21]的原子熒光法(北京瑞利儀器有限公司，AF- 610D)；IAA氧化酶(IAAO)測(cè)定采用張志良[22]分光光度法；葉片內(nèi)源IAA測(cè)定采用王若仲等[23]、Liu等[24]的方法并加以修改：采集2種植物葉片立即放入液氮中，稱取鮮樣2 g，用80%甲醇(10 mL/g FW, FW表示鮮重)研磨成勻漿(加入少量2,6-二叔丁基- 4-甲基苯酚，避免光照)、4 ℃下浸提過夜，經(jīng)4 ℃下高速離心(10000 r/min、20 min)，殘?jiān)? mL g-1次-180%甲醇洗提兩次，合并上清液，40 ℃減壓濃縮后經(jīng)聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVPP)、二乙基氨基乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠(diethyl amino ethyl sephadex gel, DEAE)和Sep-Pak C18小柱等進(jìn)行固相萃取，再經(jīng)50%甲醇洗脫、流動(dòng)相定容后上高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)分析(美國(guó)安捷倫科技有限公司，1200系列)。HPLC條件：色譜柱為反相液相C18色譜柱(5 μm, 4.6×250 mm)，流動(dòng)相為甲醇- 1%乙酸=40∶60(體積分?jǐn)?shù))溶液，柱溫為45℃，流速為0.6 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素或雙因素方差分析，并用Tukey′s HSD法進(jìn)行多重比較。顯著性差異水平P取0.05，極顯著差異水平P取0.01。用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖，SPSS 14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 砷脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

在不同濃度砷脅迫下，砷超富集植物大葉井口邊草的生物量與對(duì)照(0 mg/kg)相比無顯著變化；非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨的生物量在低、中砷濃度處理下與對(duì)照相比無顯著差異(P>0.05)，但在高砷濃度處理下則顯著降低(P<0.05)(圖1)。

砷脅迫下大葉井口邊草的株高與對(duì)照相比差異不顯著。劍葉鳳尾蕨在中、高濃度砷脅迫下株高與對(duì)照相比顯著下降，低砷濃度下則與對(duì)照無顯著差異。雙因素方差分析結(jié)果顯示，2種植物之間、砷處理濃度之間對(duì)植物的生物量和株高均有極顯著影響(P<0.01)，兩者交互作用對(duì)株高具有極顯著影響(圖1)。

圖1 砷脅迫對(duì)植物生物量和株高的影響

2.2 砷脅迫下植物葉片對(duì)砷的吸收

圖2 砷脅迫下植物葉片的砷含量

從圖2可知，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(49d)2種植物葉片中砷含量與對(duì)照相比均顯著增加，但大葉井口邊草比劍葉鳳尾蕨增加顯著。在200 mg/kg處理下，大葉井口邊草葉片含砷量達(dá)(324.45±8.47) mg/kg，而劍葉鳳尾蕨中只有(49.17±4.99)mg/kg。雙因方差分析結(jié)果表明，2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對(duì)植物葉片砷含量具有極顯著差異。

2.3 砷脅迫對(duì)植物體內(nèi)吲哚乙酸(IAA)含量的影響

2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對(duì)植物葉片IAA含量具有極顯著差異。隨著砷處理濃度的增加，除50 mg/kg砷處理下2種植物葉片中IAA含量與對(duì)照相比均無顯著差異外，100和200 mg/kg砷濃度處理均使IAA含量顯著增加，但大葉井口邊草比劍葉鳳尾蕨增加顯著，兩者達(dá)到極顯著差異水平(圖3)。

圖3顯示添加100 mg/kg砷后兩種植物葉片中IAA含量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。大葉井口邊草在培養(yǎng)13天時(shí)葉片中IAA含量達(dá)到最高，之后有所下降，但在第43天時(shí)又達(dá)到第2個(gè)高峰；劍葉鳳尾蕨在培養(yǎng)過程中葉片IAA含量總體呈上升趨勢(shì)，但整體含量水平較大葉井口邊草低。雙因素方差分析結(jié)果表明，2種植物之間、培養(yǎng)時(shí)間之間以及兩者交互作用對(duì)植物葉片中IAA含量具有極顯著差異。

圖3 砷脅迫下植物葉片中吲哚乙酸(IAA)含量和100 mg/kg處理下的時(shí)間動(dòng)態(tài)

2.4 砷脅迫對(duì)植物體內(nèi)IAA氧化酶(IAAO)活性的影響

從圖4可知，低濃度砷(50 mg/kg)脅迫下2種植物葉片中的IAAO活性與對(duì)照相比無顯著差異，但在中、高濃度砷脅迫下均較各自的對(duì)照有顯著降低，但在大葉井口邊草中降低更為顯著。雙因素方差分析結(jié)果表明，2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對(duì)植物葉片IAAO含量具有極顯著差異。

圖4顯示添加100 mg/kg砷后兩種植物葉片中IAAO活性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大葉井口邊草在培養(yǎng)13d時(shí)，IAAO活性顯著降低，在第3周左右又恢復(fù)到原來活性，之后總體呈下降趨勢(shì)；劍葉鳳尾蕨除了在培養(yǎng)37d時(shí)有短暫顯著降低外，總體上活性保持在較高水平。雙因素方差分析結(jié)果表明，2種植物之間、培養(yǎng)時(shí)間之間以及兩者交互作用對(duì)植物葉片IAAO活性均具有極顯著差異。

圖4 砷脅迫下植物葉片吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性和100 mg/kg處理下的時(shí)間動(dòng)態(tài)

圖5 砷脅迫下植物葉片抗氧化酶活性及丙二醛含量

2.5 砷脅迫下植物葉片抗氧化酶活性和丙二醛含量

2.5.1 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的變化

如圖5所示，大葉井口邊草在50 mg/kg砷處理時(shí)CAT活性與對(duì)照相比顯著增加，而中、高濃度砷處理下CAT活性又顯著降低，但能保持在與對(duì)照持平的水平；劍葉鳳尾蕨葉片中CAT活性在不同濃度砷處理下均顯著降低。除中等砷濃度處理外，大葉井口邊草葉片中的SOD活性均比對(duì)照顯著增加，但劍葉鳳尾蕨在各砷濃度處理時(shí)SOD活性均無顯著變化。大葉井口邊草葉片中POD活性在不同濃度砷處理下較對(duì)照顯著增加，而劍葉鳳尾蕨葉片中POD活性則無顯著變化。2種植物在不同濃度砷脅迫下葉片中MDA含量均顯著增加，其中，大葉井口邊草葉片MDA含量在低濃度砷處理時(shí)便顯著增加，但在中、高濃度砷處理時(shí)而又顯著回落；劍葉鳳尾蕨葉片中MDA含量在加砷處理時(shí)均顯著增高(圖5)。

雙因素方差分析結(jié)果表明，2種植物之間、砷處理濃度之間以及兩者交互作用對(duì)植物葉片抗氧化酶活性及丙二醛含量具有極顯著差異。

2.5.2 培養(yǎng)過程中的時(shí)間動(dòng)態(tài)

從圖6可知，大葉井口邊草葉片中CAT活性在培養(yǎng)13d時(shí)呈顯著下降趨勢(shì)，之后又回升至培養(yǎng)結(jié)束；劍葉鳳尾蕨葉片CAT活性在培養(yǎng)7d時(shí)顯著降低，至19d時(shí)又顯著增加，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)均無顯著變化。大葉井口邊草葉片中SOD活性在前25d無顯著變化，在第25—37天間則顯著升高，到第43天又顯著降低；劍葉鳳尾蕨葉片中SOD活性在培養(yǎng)第13天時(shí)顯著降低，第37天時(shí)才有顯著升高，之后又有所下降。大葉井口邊草葉片中POD活性在培養(yǎng)第7天時(shí)有短暫降低，之后保持升高趨勢(shì)，到第37天時(shí)達(dá)到最高峰；劍葉鳳尾蕨葉片中POD 活性在培養(yǎng)第7天時(shí)也有顯著降低，之后則無顯著變化。第31天前，大葉井口邊草和劍葉鳳尾蕨葉片MDA含量均在第7天和第19天出現(xiàn)兩次高峰，但劍葉鳳尾蕨比大葉井口邊草具有更高的MDA 含量，第31天后，2種植物的MDA含量基本趨于一致(圖6)。

圖6 100 mg/kg處理下植物葉片抗氧化酶活性和丙二醛含量的時(shí)間動(dòng)態(tài)

雙因素方差分析結(jié)果表明，2種植物之間、培養(yǎng)時(shí)間之間以及兩者交互作用對(duì)植物葉片中抗氧化酶活性及丙二醛含量均具有顯著差異。

2.6 逐步回歸分析

令y為植物葉片中IAA含量，x1為植物葉片中砷含量，x2為 植物葉片中SOD活性，x3為植物葉片中POD活性，x4為 植物葉片中CAT活性，x5為 植物葉片中MDA含量，對(duì)2種植物分別進(jìn)行多元逐步回歸分析，得到大葉井口邊草y=51.207+0.166x1-0.132x4，P=0.0001，F(xiàn)=70.987，r=0.97；劍葉鳳尾蕨y=23.948+0.565x1，P=0.01，F(xiàn)=22.210，r=0.83。因此，大葉井口邊草和劍葉鳳尾蕨葉片中IAA含量均分別與其葉片中砷含量成顯著正相關(guān)，而大葉井口邊草葉片中IAA含量還與其葉片中CAT活性成顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

本文研究了砷超富集植物大葉井口邊草和非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨經(jīng)不同濃度砷處理后葉片IAA含量、砷含量、抗氧化酶活性以及IAA含量與抗氧化系統(tǒng)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在中、高濃度砷脅迫下，砷超富集植物大葉井口邊草葉片中IAA平均含量分別為56.68和45.38 ng/g FW，而非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨中則分別為27.01和30.59 ng/g FW(圖3)。因此，在中、高濃度砷脅迫下砷超富集植物比非砷超富集植物擁有顯著高的IAA水平。隨著砷脅迫濃度增加，2種植物葉片中IAA含量均顯著增加，但砷超富集植物比非砷超富集植物增加顯著。砷超富集植物中相對(duì)高的生長(zhǎng)素含量水平一方面保證了其在砷污染土壤上的生長(zhǎng)，另一方面可能有助于植物超富集砷，2種植物葉片砷含量均值分別是324.45和49.17 mg/kg(圖2)。有研究表明，在外源添加IAA后，紫花苜蓿[10]、滇苦菜[11]、東南景天[12]的葉片對(duì)Pb的富集顯著增加；同樣Fassler等[25]在對(duì)向日葵添加10-10mol/L IAA時(shí)植物葉片的干重顯著增加并且葉片中Pb和Zn含量也顯著增加。由此可見，在外源添加一定濃度IAA后，植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)了一部分IAA，進(jìn)入植物體內(nèi)的IAA在加強(qiáng)了植物抵抗重金屬污染脅迫能力的同時(shí)，也提高了植物吸收重金屬的能力[25]。在相對(duì)高的生長(zhǎng)素支持下，超富集植物大葉井口邊草在高濃度砷脅迫下植物的生物量與對(duì)照相比無顯著影響，而非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨在同樣處理下生物量則顯著受抑制(圖1)。

吳坤等[26]以煙草(NicotianatabacumL．)為材料，添加不同濃度鎘(0，5，25，50 mg/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)鎘濃度為5 mg/L時(shí)，煙草葉片中IAA含量顯著上升，但隨著鎘濃度的增加IAA含量顯著下降。在本研究中也發(fā)現(xiàn)隨砷處理濃度增加，劍葉鳳尾蕨葉片IAA含量也顯著增加，并未出現(xiàn)下降情況，這表明砷脅迫下劍葉鳳尾蕨體內(nèi)的IAA含量能夠維持，以保證其能夠在砷污染土壤上健康生長(zhǎng)，未觀察到受害癥狀。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，劍葉鳳尾蕨在100 mg/kg濃度處理后一段時(shí)間除了長(zhǎng)勢(shì)較慢和植株矮小外，仍有大部分幼苗長(zhǎng)出且無明顯受害，大葉井口邊草在同樣情況下則能保持旺盛生長(zhǎng)。劍葉鳳尾蕨葉片中IAA的維持可能與其體內(nèi)的較低的砷含量尚不構(gòu)成毒害以及IAAO活性降低有關(guān)。面對(duì)砷脅迫，兩類植物均需先將有限的能量和資源分配到如何存活而不是大量富集砷上。但是，劍葉鳳尾蕨比大葉井口邊草具有更高的IAAO活性，從而降低了體內(nèi)的IAA含量。研究表明，生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)經(jīng)常被各種逆境脅迫(鹽性、干旱、寒冷、機(jī)械損傷和金屬脅迫等)所打破[27- 29]，從而改變了植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。生長(zhǎng)素的作用具有明顯的兩重性，低濃度生長(zhǎng)素促進(jìn)植物生長(zhǎng)，高濃度時(shí)植物生長(zhǎng)則受抑制。然而，這其中的濃度高低也有一相對(duì)閾值，在相對(duì)高的IAA濃度下，IAA能夠促進(jìn)煙草BY- 2的細(xì)胞分裂[30]。生長(zhǎng)素的原初誘導(dǎo)基因的兩個(gè)典型代表是SAUR和GH3基因家族[31- 32]，只有植物細(xì)胞中生長(zhǎng)素足夠高時(shí)細(xì)胞中的GH3基因才會(huì)最大量表達(dá)，而高濃度生長(zhǎng)素促使SAUR在莖的伸長(zhǎng)區(qū)也表達(dá)增強(qiáng)[33]。

一般植物在重金屬脅迫下體內(nèi)的活性氧(ROS)會(huì)大量增加，導(dǎo)致植物內(nèi)發(fā)生代謝紊亂，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。植物將采取各種措施消除活性氧，如不斷提高各種抗氧化酶的活性。本研究表明，在砷脅迫下，與對(duì)照(不加砷)相比，大葉井口邊草葉片中CAT、SOD和POD活性能夠維持或增加，從未出現(xiàn)下降趨勢(shì)， POD活性增加尤為顯著，表明其具有強(qiáng)大的清除自由基能力。在劍葉鳳尾蕨中，雖然SOD和POD活性在各砷處理中與對(duì)照相比均未出現(xiàn)顯著變化，但CAT活性則一直保持降低趨勢(shì)，說明其清除ROS的能力比大葉井口邊草低。

本研究對(duì)大葉井口邊草葉片中IAA含量與砷含量、抗氧化酶活性和丙二醛含量進(jìn)行逐步回歸分析，得出IAA含量與CAT活性成顯著負(fù)相關(guān)。在中、高濃度砷脅迫下，大葉井口邊草葉片CAT活性與低濃度砷脅迫相比有顯著下降(圖5)，隨著CAT活性下降，細(xì)胞中有一定量的H2O2積累。長(zhǎng)期以來，植物體內(nèi)的H2O2被看成是一種毒素，但是，H2O2也可作為一個(gè)細(xì)胞的信號(hào)分子和一些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑[34]，H2O2參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而導(dǎo)致對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)[35]。另外，在生長(zhǎng)素信號(hào)通道和氧化還原作用的信號(hào)通道之間的動(dòng)態(tài)相互影響能夠靈活地對(duì)細(xì)胞的新陳代謝作出高度響應(yīng)[36- 37]。還有研究表明，H2O2可作為信號(hào)分子促進(jìn)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的不定根形成[38]。據(jù)報(bào)道，植物組織能耐受高濃度的H2O2，范圍為102—2×105μmol/L，原因是植物抗氧化反應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)更多的是為了控制細(xì)胞氧化還原電位狀態(tài)，而不是將H2O2完全清除[39]。此外，本研究逐步回歸分析結(jié)果表明，由于CAT活性降低帶來了IAA含量增加。生長(zhǎng)素過量時(shí)也會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，但是，植物體內(nèi)的IAA絕大多數(shù)以非活性的共價(jià)化合物形式存在[40]。內(nèi)源IAA的濃度受3個(gè)主要的過程調(diào)節(jié)：生物合成、降解和結(jié)合反應(yīng)[41]，GH3基因家族的多個(gè)成員是IAA-酰胺連接酶，能使生長(zhǎng)素與氨基酸結(jié)合，從而降低了自由態(tài)生長(zhǎng)素的含量，很多生長(zhǎng)素會(huì)和糖苷、酰胺基結(jié)合[42]。結(jié)合途徑對(duì)植物來說具有重要的生理意義，可以有效調(diào)節(jié)植物組織中內(nèi)源生長(zhǎng)素的含量[40]，因此，大葉井口邊草中相對(duì)高的IAA水平有利于生長(zhǎng)素在自由態(tài)和結(jié)合態(tài)中的轉(zhuǎn)化。然而，非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨中，中、高濃度砷脅迫下的CAT活性與對(duì)照相比無顯著變化(圖5)，也未發(fā)現(xiàn)該種植物中CAT與IAA的相關(guān)性。因此，在大葉井口邊草中，低濃度砷處理下CAT活性顯著升高有利于清除細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的活性氧，但是仍能將活性氧(如H2O2)維持在一定水平，隨著砷脅迫濃度的提高，CAT活性又顯著下降，使細(xì)胞內(nèi)的IAA有所增加。雖然在高砷處理時(shí)大葉井口邊草中CAT活性有顯著下降，但能維持在與對(duì)照(不加砷)一致的水平，有利于植物體內(nèi)抗氧化與維持相對(duì)高含量IAA的平衡。除我們的研究表明在砷超富集植物中葉片IAA含量受CAT調(diào)節(jié)外，最近有研究表明，添加外源生長(zhǎng)素(0—25 nmol/L)能增加野生型西紅柿(Solanumlycopersicum)根尖H2O2的含量，并存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，這表明在根的生長(zhǎng)部位，H2O2含量也受生長(zhǎng)素的調(diào)節(jié)[43]。生長(zhǎng)素能刺激羥基自由基的形成，進(jìn)而能增加細(xì)胞壁的伸展性[44]。因此，生長(zhǎng)素和氧自由基的作用關(guān)系和調(diào)節(jié)規(guī)律非常復(fù)雜，還有很多工作需要開展。

此外，本研究的時(shí)間動(dòng)態(tài)研究表明，在第13天，砷超富集植物大葉井口邊草具有最高的IAA含量、最低的IAAO活性以及最低的CAT活性，而劍葉鳳尾蕨中的變化規(guī)律則不明顯，這三者之間的調(diào)控機(jī)理特別是CAT在生長(zhǎng)素含量調(diào)節(jié)中的作用需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究表明，砷超富集植物大葉井口邊草在中、高濃度砷脅迫下能夠維持生長(zhǎng)，而非砷超富集植物劍葉鳳尾蕨生長(zhǎng)則受抑制，這一方面是因?yàn)榇笕~井口邊草葉片中抗氧化酶活性(CAT、SOD和POD)能夠維持或增加，從而能夠抵抗砷毒害導(dǎo)致的氧化脅迫，而劍葉鳳尾蕨中這3種抗氧化酶的活性則無顯著變化或顯著減少，說明其抗氧化能力比大葉井口邊草低；另一方面則與砷脅迫下大葉井口邊草葉片中內(nèi)源IAA含量比劍葉鳳尾蕨增加顯著、且具有更低的IAAO活性有關(guān)，而相對(duì)高的內(nèi)源IAA含量能夠維持其在植物內(nèi)的合成、運(yùn)輸和分配的平衡，從而更好地促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和分化。2種植物葉片IAA含量均與砷含量成顯著正相關(guān)，但大葉井口邊草葉片IAA含量還與CAT活性成顯著負(fù)相關(guān)，因此，葉片保持較高的IAA含量、較低的IAAO和CAT活性有助于大葉井口邊草超量富集砷。

致謝：云南省煙草科學(xué)研究院楊光宇副研究員幫助植物激素測(cè)定，昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院潘波教授幫助寫作，特此致謝。

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The relationship between endogenous auxin and antioxidative enzymes in two plants with different arsenic-accumulative ability under arsenic stress

HU Yongjun, WANG Haijuan, WANG Hongbin*, YANG Xiaoyan, LI Yanyan, YIN Fei

FacultyofEnvironmentalScienceandEngineering，KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China

Up to now, 11 arsenic hyperaccumulators and 4 non-hyperaccumulators inPterisgenus have been reported. The non-hyperaccumulators could be used as controls to reveal the responsive mechanisms of hyperaccumulators to arsenic pollution. Auxin plays an important role in plant cell growth, differentiation and division. In the present research, one arsenic hyperaccumulator (Pteriscreticavar.nervosa)and one non-hyperaccumulator (Pterisensiformis) were selected fromPterisgenus to evaluate the effects of arsenic stress (0, 50, 100 and 200 mg/kg) on the plant biomass, height, frond indole- 3-acetic acid (IAA) contents, arsenic accumulation, the activities of IAA oxidase and antioxidative enzymes (superoxide dismutase SOD, peroxidase POD and catalase CAT), as well as the content of malondialdehyde (MDA, a per-oxidation product of cell membrane lipid) using a pot experiment. The relationship among the contents of IAA, arsenic concentration, activities of 3 antioxidative enzymes and MDA contents in the fronds of two plants were also analyzed by step regression statistical method. In addition, the variation of IAA, IAAO, SOD, POD, CAT and MDA in two plants exposed to 100 mg/kg arsenic with culture time was examined. No significant difference was observed in the biomass and height ofP.creticavar.nervosaunder arsenic stress compared to the control (0 mg/kg), but a significant decrease was noted inP.ensiformisunder medium or high arsenic stress. The concentrations of arsenic and IAA increased but the activity of IAAO decreased in the fronds of two plants exposed to medium or high arsenic stress, but this change was more significant inP.creticavar.nervosa. The activities of 3 antioxidative enzymes could maintain or increase in the fronds ofP.creticavar.nervosaexposed to arsenic stress, but a significant decrease of POD was observed inP.ensiformis, in which the activities of SOD and CAT could maintain. Therefore, much stronger antioxidative ability was shown inP.creticavar.nervosaexposed to arsenic stress. The results from step regression analysis showed a significantly positive correlation between the IAA contents and arsenic concentrations in the fronds of two plants, and a significantly negative correlation was also observed between the IAA contents and CAT activities in the fronds ofP.creticavar.nervosa. The result from time-course effect research showed that the highest IAA contents, the lowest IAAO and CAT activity were found in the 13th days in the culture process ofP.creticavar.nervosaexposed to 100 mg/kg, but similar result was not observed forP.ensiformis. Therefore, a higher IAA contents, a lower IAAO and CAT activities may have contributed to arsenic hyperaccumulation inP.creticavar.nervosa.

auxin; indole- 3-acetic acid (IAA); arsenic; antioxidative enzymes;Pteriscreticavar.nervosa;Pterisensiformis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360132); 云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目(2012HB007)

2013- 12- 02;

2014- 08- 13

10.5846/stxb201312022863

*通訊作者Corresponding author.E-mail: whb1974@126.com

胡擁軍, 王海娟, 王宏鑌, 楊曉燕, 李燕燕, 殷飛.砷脅迫下不同砷富集能力植物內(nèi)源生長(zhǎng)素與抗氧化酶的關(guān)系.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(10):3214- 3224.

Hu Y J, Wang H J, Wang H B, Yang X Y, Li Y Y, Yin F.The relationship between endogenous auxin and antioxidative enzymes in two plants with different arsenic-accumulative ability under arsenic stress.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3214- 3224.