獻血者抗-HCV檢測及確認結果研究進展

張秀慧 鐘政榮 余加宏

丙型肝炎病毒(HCV)全球感染率約2.35%，慢性感染人口約有 1.6億［1］。我國 HCV的感染率為3.2%［2］。HCV的傳播途徑主要是因輸血或血液制品，有關調查研究顯示隨著輸血量的增大，輸血后丙型肝炎感染的危險性隨之增大［3］。因此，如何更好的提高HCV檢出的靈敏度、減少漏檢、保障血液安全一直是人們注意的焦點。但在低感染率人群中，間接酶聯免疫(ELISA)法檢測丙肝抗體(抗HCV)存在較高的假陽性率。血站目前多數采用兩遍ELISA法對血液進行抗-HCV的檢測，其反應性樣本確證陽性率較低，約30%左右;單試劑反應性樣本和灰區反應性樣本的陽性率則更低，這使得很多獻血者被誤淘汰，因此，近幾年越來越多的輸血領域學者在關注獻血者歸隊問題［4，5］。故為了避免假陽性結果對獻血者心理造成不良影響及減少獻血人員的流失，對初篩結果做進一步確認的重要性也日益突出。同時，陰性樣本經核酸檢測的確證試驗發現也存在一定的漏檢率。本文將對丙肝抗體的確認情況研究進展綜述如下。

1 HCV的生物學性狀及臨床意義

HCV病毒體呈球形，直徑＜80 nm(肝細胞中為36～40 nm，在血液中為36～62 nm)，外有脂質外殼、囊膜和棘突結構，內有由核心蛋白和核酸組成的核衣殼。HCV為單股正鏈RNA病毒，由9 500～10 000 bp組成，基因組序列具有高度變異性，分為6個基因型和80多種基因亞型。其RNA由編碼區(9 030 bp)、5-非編碼區(332 bp)和3-非編碼區(54 bp)組成。編碼區包括結構區和非結構區(NS)基因。結構基因分C區和E區，相應的編碼產物是核心蛋白和包膜蛋白，由它們組裝病毒顆粒。非結構基因分為NS1、NS2、NS3、NS4、NS5 基因，相應的編碼產物是 NS1、NS2、NS3、NS4、NS5 蛋白［6］。

HCV主要經血液或血液制品傳播，感染人體后引起丙型肝炎，其中輸血后肝炎(PTH)中有90%為丙型肝炎［7］。由于丙肝病毒是RNA病毒，極易變異，目前尚未研制出有效預防丙型肝炎的疫苗。而且丙型肝炎在臨床上易轉化為慢性丙型肝炎、肝硬化，最后發展為肝癌，嚴重危害患者健康和生命。

2 HCV的傳統檢測方法

人體感染HCV后產生抗HCV，1990年開始被美國FDA批準作為感染HCV的標志。目前，國內外對獻血者丙肝病毒的篩查主要采用間接ELISA法檢測抗HCV。ELISA法是應用最為廣泛的酶免疫測定技術。其基本原理是將抗原(抗體)在不破壞其免疫活性的條件下預先結合到固相載體表面，再將待測抗體(抗原)和酶標抗原(抗體)按一定順序與結合在固相載體上的抗原(抗體)反應并形成免疫復合物，經洗滌去除反應體系中的其他物質，使固相載體上的免疫復合物與待測抗體(抗原)的量呈一定比例，加入酶反應底物后，底物即被固相載體上的酶催化變為有色產物，最后根據顏色深淺進行定量或定性分析。ELISA是一種定性試驗，其判斷有無反應性的標準是根據被檢測樣本與試劑反應終止后的吸光度值是否大于閾值來決定。它具有價格低廉、反應時間短、操作簡單、對環境及設備要求不高等優點，被廣泛應用于采供血系統以及臨床檢測。

采供血系統采用的間接ELISA試劑盒已經發展到第3 代，所用抗原包括了 C、NS3、NS4、NS5，較第 1、2 代大大提高了抗HCV檢出率。但由于:①抗HCV的“窗口期”特別長，即人體從感染HCV到產生抗HCV需要的時間，45 ～68 d［8］;②目前，抗HCV ELISA 試劑盒均采用基因工程或合成多肽抗原包被固相，以間接法測定，由于HCV為RNA病毒，抗原易產生變異，其特異性方面存在不足;③不同的ELISA試劑生產廠家包被抗原的來源和組成上存在差異;④工作人員操作不當等。采供血系統工作人員在篩查無償獻血者這種低危人群的血液標本時，常出現灰區或單試劑呈反應性的標本，難以判讀結果。

宋美蘭等［9］對常規國產和進口雙試劑ELISA篩查抗HCV不合格的184份標本采用核酸和血清學重組免疫印跡試驗(RIBA)加以確認，在抗HCV篩查不合格標本中，抗HCV ELISA雙試劑陽性、單試劑陽性、灰區標本的假陽性率分別為23.9%、95.2%、96.1%，總假陽性率為67.9%。許曉絢等［10］對51例采用3種進口抗HCV ELISA試劑同時篩查抗HCV結果不一致的弱陽性標本，用重組免疫印跡試驗和核酸檢測進行確證，單一ELISA試劑假陰性率19.24% ～72.41%，試劑兩兩組合后假陰性率4.76% ～30.95%。因此，血站系統采用兩個不同生產廠家的ELISA試劑僅可以一定程度的降低血液篩查中的假陰性率或假陽性率，但仍存在較高的比例，尤其是在弱反應性的灰區標本中。

目前，有試劑廠家研制出雙抗原夾心法檢測抗HCV的試劑盒，又被稱為抗HCV“第4代”診斷試劑盒。其檢測原理是用多表位HCV嵌合抗原(RHCVNS4-C-NS3-NS5)包被微孔酶聯板，用修飾的HCV嵌合抗原標記長臂生物素(LC-Biotin-HCV-Ag)、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶(SA-HRP)及其他輔助試劑制成，應用雙抗原夾心酶聯免疫法原理檢測血漿中的丙型肝炎病毒抗體。該檢測方法在間接法檢測IgG的基礎上，增加了IgM的檢測，大大縮短了窗口期，提高了抗HCV的檢出率;同時通過使用生物素-親和素級聯放大系統，對試劑的特異性有了大幅度提升，實驗表明夾心法與RIBA的符合率為78.8%，遠高于國產或進口間接法與 RIBA 的符合率(60.5%，50.0%)［11］。有研究報道，雙抗原夾心法檢測抗HCV所產生的灰區和假陽性標本大幅度減少，已獲得我國國家食品藥品監督管理總局(CFDA)的批準［12］。

ELISA試劑造成的假陰性或假陽性問題，不但給血液安全帶來極大威脅，而且導致了獻血源的浪費及帶給獻血者極大的心理壓力，不利于獻血事業的可持續發展。國外對血液篩查不合格的樣本常規進行確證試驗，并對假陽性樣本的相應獻血者保留獻血資格，再次體檢合格后仍可參加無償獻血，即獻血者歸隊政策［4］。近幾年來，我國學者對獻血者歸隊政策也極為關注，通過研究提出了適合我國的抗HCV假陽性獻血者歸隊方案［13］:①對實驗室篩查抗HCV不合格的血液作報廢處理，暫時屏蔽相關獻血者;②對抗HCV反應性獻血者進行2次不同試劑ELISA檢測和HCVRNA檢測，如抗HCV雙試劑反應性或HCV-RNA反應性，則獻血者永久屏蔽;對抗-HCV ELISA單試劑反應性且S/CO＜3.8(以Ortho為例)，HCV-RNA陰性的獻血者180天后進行隨訪檢測，若包含原試劑在內的2種試劑均為無反應性，且HCV-RNA為陰性，則該獻血者可解除屏蔽恢復獻血權利。劉宇寧［5］等抽取2004年到2006年上海市奉賢區血站血液抗HCV不合格樣本82份，經ELISA試劑復檢及核酸檢測確證，結果復檢假陽性歸隊率為54.88%，確證假陽性歸隊率為10.98%。由此可以看出抗HCV篩查的假陽性歸隊率是很高的，為了更大程度的保留獻血源，對抗HCV檢測的初篩結果做進一步的補充確證試驗是很有必要的。

3 HCV檢測的確證試驗

目前，國內外公認的HCV檢測的補充確認試驗有2個，即重組免疫印跡法(RIBA)和丙肝病毒核酸檢測(NAT)。近幾年，抗HCV分片段酶聯免疫確認試驗也被用作抗HCV的確證試驗。

3.1 抗HCV重組免疫印跡法(RIBA) 免疫印跡試驗的特點是利用聚丙烯酞胺凝膠電泳的分子篩和電泳的雙重作用，將不同分子量蛋白和多肽由上而下分成不同條帶，當這些條帶轉移到固相載體(例如硝酸纖維素膜)上，即可和相應抗體起免疫反應，再與酶標記的第2抗體起反應，經過底物顯色以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。RIBA也是一種定性試驗，其區別于ELISA的是在固相載體上將不同抗原分成不同的條帶而非混在一起包被到固相載體上，更具針對性，特異性高，可用于確證試驗。RIBA的結果根據顯色條帶的多少及顯色的深淺分為陰性、不確定性、陽性。重組免疫印跡試驗是ELISA法篩查抗HCV可疑標本的確證試驗，已發展到第3代，測試條帶覆蓋有 c22p、c33c、c100p、NS5 等4 個條帶，分別代表了核心抗原和NS3、NS4、NS5抗原。

但由于RIBA試劑價格昂貴，試驗技術要求高，操作復雜，在實際的血液篩查工作中難以推廣。然而，一些學者認為ELISA法檢測抗HCV的S/CO值大小與RIBA確證陽性有一定的相關性。有研究者對經ELISA試劑篩查抗HCV有反應性的標本用RIBA進行確證試驗，結果表明，當S/CO值≥3.8這一閾值時，陽性預測值在95%以上，可以替代RIBA確證試驗，降低試驗成本［14］。但不同的生產廠家的抗HCV ELISA試劑有各自不同的閾值，并且同一試劑在不同地區的閾值也存在差異［15，16］。這可能是由于不同的ELISA試劑生產廠家包被抗原的來源和組成上存在差異以及不同地區丙型肝炎的流行毒株基因型不同所致。

此外，研究［17］還發現，對用兩個不同生產廠家的抗HCV ELISA試劑檢測的標本中，檢測結果顯示單試劑反應性的大多數標本經RIBA確認為陰性，但存在一定比例的不確定標本。Pereira等［18］對14例RIBA檢測結果為不確定標本進行追蹤調查，6個月后重新取樣做RIBA確證試驗，有20%標本確證為陰性，仍有80%標本存在不確定性。有研究者對RIBA不確定的標本進行了 NAT 檢測，均未檢測出 HCV-RNA［19，20］。Makuria等［21］認為標本RIBA不確定反應是由于既往感染HCV，恢復階段抗體最終消失前殘留丙肝病毒感染過的血清學證據。

再者，RIBA也是通過檢測抗HCV的有無來確證HCV感染的，同樣存在窗口期，僅能用于確證試驗，不能用于HCV感染早期檢測。

3.2 抗HCV分片段酶聯免疫確認試驗 抗-HCV分片段酶聯免疫試劑是一種國產的抗HCV確證試劑，其基本試驗原理與國外重組免疫印跡分析法相似，它將HCV抗原分為 C、NS3、NS4、NS5幾個片段，分別包被在不同的酶標板上，用酶聯免疫法對不同片段進行分別檢測。

葉國強等［22］用國產的HCV分片段酶聯免疫試劑檢測經HCV RIBA 3.0確認的82份陽性標本中HCVC、NS3、NS4、NS5抗體并與之比較，總的檢測率基本一致，有很高的符合率。也有研究［23］表明，HCV分片段酶聯免疫確認試劑對單試劑反應性及灰區標本具有較好的確認性。HCV分片段酶聯免疫試劑價格相對便宜，試驗方法成熟，操作簡單，易于推廣。

3.3 丙肝病毒核酸檢測(NAT) 早在1997年德國首先對HCV實施了核酸檢測，隨后美國、英國、瑞士等一些發達國家也對HCV實施并強制施行了HCV的核酸檢測［24］。隨著核酸檢測技術自動化及試劑商品化的實現，多數國家都實施了丙肝病毒的核酸檢測，我國也正在血液篩查中逐漸推廣并普及該項技術［25］。

核酸檢測技術是一系列能直接檢測病原體核酸的技術總稱，主要原理是使用一些物理學、化學和生物學技術和方法，通過其附帶的信號擴增或靶核酸直接擴增方法，讓肉眼看不見的極微量的核酸變成能直接觀察的光電或可視信號，從而判斷檢測標本中是否存在相應的病原體。目前，血站系統采用的核酸檢測方法主要有TMA 和 PCR兩種。有研究［26，27］表明，這2種核酸檢測方法在HCV-RNA檢測的靈敏性、特異性和早期診斷方面，經統計學分析差異無統計學意義，都有較高的靈敏性和特異性，可以縮短窗口期，大大提高血液及輸血的安全性。但不同廠家的核酸檢測試劑檢測結果有一定的差別。谷金蓮等［28］對3種使用廣泛的國產HCV-RNA定量檢測試劑與進口羅氏HCV-RNA定量檢測試劑進行比較，發現國產試劑的陽性檢出率顯著低于羅氏等進口試劑，且在HCV-RNA載量小于50 U/mL時，有較高的漏檢率，而3種國產試劑之間陽性檢出率無明顯差異，因此，國產試劑的靈敏性還需進一步提高。

國內外學者對ELISA法雙試劑進行獻血者抗HCV的篩查，而后由NAT法確證，具體確證結果見表1。我們發現ELISA法雙試劑檢測抗HCV為陽性的樣本中，確證陽性率為30% ～40%，最高有近70%為HCV-RNA檢測陰性，表明ELISA法有較高的假陽性率，這可能由于健康人感染HCV后人體對丙肝病毒自限清除，或治療后HCV暫時沒有復制。黃成垠等［29］檢測出1例ELISA法雙試劑檢測抗HCV陰性而NAT陽性的樣本，并在68 d后復查抗HCV的結果為陽性，表明該樣本的獻血者處于HCV感染窗口期，存在病毒復制，但HCV抗體尚未形成。ELISA法雙試劑檢測抗HCV陰性的樣本中NAT確證陽性率為十萬分之一，特異性逼近100%，能夠最大程度的保證血液的安全性。NAT直接檢測病毒核酸的有無，是病毒存在的“金標準”，但劉峭梅等［30］發現約有0.71%的樣本NAT檢測為陰性而ELISA檢測為陽性，表明仍不能忽視ELISA法在血液篩查的作用，ELISA法檢測的是HCV抗體，NAT法檢測的是HCV-RNA，采用這兩種方法對同一標本的檢測結果不是重復而是互補的。

表1 HCV采用雙試劑ELISA法篩查NAT確證結果

4 確證試驗在實際工作中的應用價值

目前，我國血站系統多采用2個不同生產廠家的ELISA試劑，對無償獻血者進行血液安全性篩查。但由于ELISA法“窗口期”較長，且不同生產廠家ELISA試劑盒酶標板包被的抗原比例不同、不同操作者之間操作誤差較大等影響因素的存在，不可避免導致的誤檢率和漏檢率。確證試驗可降低在篩查低危人群抗HCV時所產生的假陽性及假陰性結果，提高陽性檢出率及結果的準確性。對確證為假陽性的獻血者實施歸隊政策，避免了血液資源的浪費，有利于無償獻血事業的可持續發展。確證試驗對血液安全及用血安全都有一定的實用價值，能夠最大程度的減低輸血性丙型肝炎的傳播。

綜上所述，丙肝病毒ELISA法檢測存在較高的誤檢和漏檢率，其檢測靈敏性僅有30% ～60%，對某些弱陽性樣本的漏檢率也在70%以上，尤其是單試劑和灰區的標本其檢測特異性更低。這會造成大量的獻血者被誤判，且給獻血者帶來很大的思想負擔，也會造成獻血資源的浪費。有些廠家對第3代ELISA法抗HCV試劑進行改進，以提高其靈敏度和特異性，雙抗體夾心法及抗原抗體聯合檢測應是發展的方向。為了提高血液及用血安全，也為了減少血液資源的浪費，丙肝病毒的確證試驗是很有必要的。RIBA法是最早的確證試驗，其缺點是試驗結果中存在一部分不能確定的標本，一般建議跟蹤隨訪或作進一步的NAT檢測，而NAT的確認結果均為未檢測到HCV-RNA。NAT法直接檢測病毒核酸，是病毒存在的“金標準”，實驗結果表明，經ELISA法抗HCV雙試劑檢測陰性樣本經核酸檢測仍有一定比例的陽性率(其陽性率約在十萬分之一)，說明輸血的安全風險依然存在。不同生產廠家的試劑其檢測結果有一定的差別，血站實驗室應綜合考慮實驗室的具體情況，選擇特異性和靈敏度均較好的核酸檢測試劑。但NAT不能取代ELISA，二者在檢測原理及方法上均為互補，聯合檢測是目前安全合理的血液篩查手段。使用RIBA和NAT方法對ELISA抗HCV的檢測結果進行進一步的復核與確認，可以為獻血者的歸隊提供可能，也為獻血者提供實驗室診斷依據。但是因為RIBA法和NAT法的檢測成本都較高，因此在保證血液安全的基礎上如何更好地降低檢測成本，將是我們努力的目標。

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(2014－07－04收稿 2014－08－26修回)