免疫性血小板減少癥大鼠模型骨髓基質細胞和TPO的變化

★ 彭文虎 盧曉南 徐國良 嚴小軍 劉紅寧 尚廣彬

(1. 江西中醫藥大學/江西省中醫病因生物學重點實驗室 南昌 330004；2 .江西中醫藥大學基礎醫學院 南昌 330004)

?

免疫性血小板減少癥大鼠模型骨髓基質細胞和TPO的變化

★ 彭文虎1盧曉南2徐國良1嚴小軍1劉紅寧1尚廣彬1

(1. 江西中醫藥大學/江西省中醫病因生物學重點實驗室 南昌 330004；2 .江西中醫藥大學基礎醫學院 南昌 330004)

目的：通過建立免疫性血小板減少癥(ITP)大鼠模型，觀察其對血液中血小板生成素(TPO)和骨髓微環境中基質細胞的影響。方法：將18只SD大鼠依據外周血小板數量隨機均分為正常組、模型組，模型組大鼠于1、3、4、6、7、8天腹腔注射兔抗大鼠血小板血清(APS)，正常組大鼠注射相應量的生理鹽水。觀察各組動物外周血象的變化，實驗結束后進行骨髓涂片，ELISA檢測血漿中TPO的含量，體外培養并觀察骨髓基質細胞生長狀況。結果：與正常組比較，模型組動物血小板數量、TPO含量均顯著下降(P<0.05)，骨髓涂片巨核細胞數目沒有明顯變化(P>0.05)，基質細胞貼壁時間和貼壁率也顯著下降(P<0.05)。結論：免疫性血小板減少癥大鼠模型血小板數目降低可能與TPO含量和骨髓微環境基質細胞生長狀況密切相關。

免疫性血小板減少癥；大鼠模型；骨髓基質細胞;實驗研究

免疫性血小板減少癥是以血小板減少、血小板生存時間縮短及抗血小板自身抗體出現為特征的疾病，其發病原因未明，但已肯定的是它與血小板相關抗體(PAIgG)升高有關， PAIgG與血小板上相關抗原結合，導致血小板被破壞，引起血小板數量減少，出現紫癜、出血等癥狀。還可能是血小板生成不足引起的，血小板是由骨髓微環境中巨核細胞逐步生成并釋放到外周血中，其與骨髓微環境的狀況密切相關。自從蔣文明等[1]利用兔抗大鼠血小板血清建立血小板減少癥模型以來，關于治療血小板減少癥的藥效學研究大多基于大鼠或小鼠的這種模型進行，但迄今為止很少有研究來揭示模型中APS對巨核細胞生成血小板周邊骨髓微環境的影響。本研究利用APS建立免疫性血小板減少癥模型并研究其對骨髓微環境主要組成成分——骨髓基質細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 血小板生成素(TPO) ELISA試劑盒購自湖北優爾生科技股份有限公司，生產批號：L150115414,卡介苗購自佛山市南海百合醫療科技有限公司，生產批號：00283，IMDM培養基購自SIGMA,生產批號：SLBH1594V，小牛血清購自浙江天杭科技有限公司，生產批號：130203。全自動動物血細胞分析儀(深圳邁瑞BC-2800 Vet)，臺式離心機(上海安亭科學儀器廠TDL-60B)，CO2培養箱(美國Thermo Scientific Forma 3111),顯微鏡(日本奧林巴斯IX71),酶標儀(美國MD公司Spectra Max Plus384)。

1.2 實驗動物 SD大鼠，清潔級，體重 150～180g，雄性，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2013-0004。日本大耳兔，清潔級，2 kg，由南昌龍平兔業有限公司提供，許可證號：SCXK(贛)2013-0001。

1.3 兔抗大鼠血小板血清(APS)的制備及檢測 APS制備參考蔣文明等[1]做法，加以改進。SD大鼠，戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，肝素抗凝，800 r/min離心15 min，取上層富含血小板血漿，3000 r/min離心10 min沉淀血小板。PBS洗滌血小板，調整血小板數至1×109個/L。將上述血小板懸液與等體積完全弗氏佐劑混合，制成完全弗氏佐劑抗原，在兔兩后肢足墊、腹部及背部進行多點皮下注射，每只注射佐劑抗原4 ml。首次注射后于1、2、4周，分別取上述相同濃度血小板懸液與不完全弗氏佐劑等體積混合制成不完全弗氏佐劑抗原，多點皮下注射增強免疫，每次每只4 ml。第5周，頸總動脈取血，室溫放置1 h，3000 r/min離心20 min，分離血清。進行紅細胞吸附后ELISA法檢測兔抗大鼠血小板血清的效價。

1.4 免疫性血小板減少大鼠模型制作及檢測 將18只150g左右的SD大鼠眼眶取血測其血小板后，根據其血小板數量將大鼠隨機分為正常組、模型組，每組9只。模型組的大鼠于1、3、4、6、7、8天按1ml/200g的量腹腔注射1:4稀釋的APS，正常對照組注射同體積的生理鹽水。停止注射APS后的第2天即造模第10天，將各組動物眼眶靜脈取血作外周血象檢測，離心分離血漿按照ELISA說明書測定各組樣品中TPO的含量。

1.5 大鼠骨髓涂片 檢測外周血象后脫臼處死動物，無菌條件下取出兩側的股骨，剝離干凈，用PBS將一根股骨中的骨髓沖出后涂片，分別過6號針頭，4號針頭，離心，取出100ul制成骨髓涂片，晾干，瑞氏-姬姆薩染色，觀察計算整張玻片骨髓巨核細胞數目

1.6 骨髓基質細胞培養 剪去另一股骨兩端，IMDM 培養液沖出骨髓細胞，制備單細胞懸液，調整細胞密度，以 1×107 個/ mL 接種在12孔板中，置于 5%,37℃，CO2 培養箱中培養，第3、5天觀察其貼壁率情況。

1.7 統計學方法及分析 采用Graphpad prism 5軟件，數據以平均數和標準差(X±SD)表示，用單因素方差分析進行統計分析，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫性血小板減少大鼠造模前后血小板數目的變化 經檢測制備的兔抗大鼠血小板血清(APS)ELISA效價隨著稀釋倍數的增大，OD值逐漸減小，效價逐漸降低。與陰性對照組相比較，APS稀釋512倍仍然大于陰性對照組的10倍。經過注射APS造模后，血小板數目變化結果如表1所示：造模后的大鼠血小板數量降低明顯，幾乎是正常組和造模前的一半，有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組大鼠造模前后血小板數目的比較(×109個/L，n=9)

2.2 血小板減少癥模型大鼠中巨核細胞數目的變化 造模后眼眶取血,確定血小板明顯降低(見表1) ,取各組動物的股骨骨髓涂片,顯微鏡下統計大鼠骨髓巨核細胞數目,與正常組相比,模型組巨核細胞數目稍有下降,但沒有統計學意義(P>0.05)。

表2 ASP對骨髓巨核細胞的影響 (n=9)

2.3 各組動物血漿中TPO含量比較 實驗結果如表3所示：大鼠經APS干預造模后其血漿中的TPO含量與正常組比較顯著減少，有顯著性意義(P<0.05)。

表3 各組動物血漿中TPO含量 (n=9)

2.4 骨髓基質細胞生長狀況 骨髓基質細胞培養24h后，細胞逐漸開始貼壁生長，以長梭形為主，偶見三角形、多角形等。培養3天、5天時骨髓基質細胞貼壁情況如表4所示：模型組基質細胞貼壁率明顯比正常組要低得多 ，有顯著性差異(P<0.05)。

表4 各組動物骨髓基質細胞貼壁率情況 (n=9)

3 討論

免疫性血小板減少癥是以全身皮下紫癜或內臟黏膜出血為其臨床表現特征的一種出血性疾病[2]。它的發病機理不明，目前的研究主要集中在血小板破壞增加和生成減少兩個方面，都與血小板相關抗體密切相關，它與血小板上相關抗原結合破壞血小板，或與帶相同抗原的巨核細胞結合影響血小板形成，臨床表現為巨核細胞不變或增多，伴隨成熟分化障礙，血小板急劇下降[3]。本實驗利用外源APS注射動物，血小板數目極顯著降低(P<0.01)，同時巨核細胞數目基本沒有變化，巨核細胞成熟程度分類及所占比例可能發生了變化，這與免疫性血小板減少癥的臨床表現一致，說明模型成功建立。

血小板生成素(TPO)主要存在于肝、腎中，少量在脾和骨髓，1994年得到純化并被確定為巨核細胞分化、成熟和血小板生成的特異性調控因子，并影響血小板的功能。而在免疫性血小板減少癥中TPO含量方面，存在著很大爭議[4]。有動物實驗和臨床研究認為ITP患者[5]和動物[6]的TPO濃度顯著高于正常對照組，可能是患者血小板生成明顯減少，血小板表面吸附的TPO減少，致使循環中TPO濃度升高。也有文獻報道[7-8]ITP患者的血液TPO水平略低于對照組，其原因為ITP血小板破壞而數量減少，巨核細胞增生卻成熟障礙，增多的巨核細胞吸附了循環中的TPO，維持血中TPO水平正常偏低，甚至更低，這與本實驗結果一致：模型組血漿中TPO顯著降低(P<0.05)。

骨髓基質細胞是骨髓內包括成纖維細胞、內皮細胞等多種的總稱，其分泌的細胞因子、黏附分子、細胞外基質等形成復雜的網絡系統，構成了造血微環境，在造血干細胞向巨核細胞分化，以及巨核細胞最終成熟釋放血小板均起到關鍵作用。例如分泌TPO、IL等促巨核細胞增殖、分化作用的細胞因子，因此骨髓微環境中基質細胞的生長狀況直接影響到巨核細胞及血小板的數量。通過注射APS可能會影響骨髓基質細胞構成的微環境，造成巨核細胞成熟障礙，血小板降低。我們體外培養骨髓基質細胞的實驗也證明了這一推測：相同時間內模型組大鼠基質細胞的貼壁率明顯低于正常組(P<0.05)，但血小板相關抗體如何影響骨髓微環境中基質細胞，以及基質細胞與巨核細胞增殖分化生成血小板的具體機制有待進一步研究。

[1]蔣文明, 鄧常青, 陳大舜,等. 大鼠免疫性血小板減少模型的研究. 中國實驗動物學報[J]．1996, (02): 104-108.

[2]中華醫學會血液學分會血栓與止血學組.成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版) [J]．中華血液學雜志，2011，32(3)：214-216.

[3]秦平，侯明. 2012版成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識解讀[J]． 臨床血液學雜志,2013(2):151-155.

[4]崔慶榮，初杰，楊廣棟. TPO和TGF-β1在特發性血小板減少性紫癜發病機理中的作用探析[J]． 遼寧中醫藥大學學報,2014，(6):82-84.

[5]李楊，曲道煒，林庶如，等. 紫癜湯及其拆方對特發性血小板減少性紫癜模型小鼠網織血小板和血小板生成素的影響[J]． 中國中醫藥信息雜志,2014,21(6):53-56.

[6]王紅美，沈柏均，時慶，等. TPO和TGF-β1在兒童ITP 發病中的意義[J]． 臨床血液學雜志，2002，15 ( 5 )：218-220.

[7]許冰瑩, 尚學琴, 楊玲, 等. ITP 患者促血小板生成素水平和白細胞介素-11 水平的檢測及意義[J]． 昆明醫學院學報, 2006,5:550-551.

[8]劉娟，馬驥. 紫癜顆粒對ITP小鼠外周血小板調控因子影響[J]．遼寧中醫藥大學學報[J]．2014，(08)：45-47.

國家自然科學基金項目(81260653)；江西省自然科學基金項目(20114BAB215039)；江西省教育廳科技計劃項目(GJJ13582)；江西省衛生廳中醫藥科研計劃項目(2013A006)。

尚廣彬，男，講師。研究方向：中西醫結合基礎。E-mail: shanggb107@126.com.

R52

B

2015-04- 25)編輯：王河寶